Visual Universitätsmedizin Mainz

TRP X43 Untersuchung der cAMP/PKA- und cGMP/PKG-Signalwege in humanen und murinen Blutplättchen

Förderzeitraum: 01.04.2020 – 30.06.2020

Projektskizze

Von Endothelzellen gebildetes Prostazyklin und Stickstoffmonoxid (NO) sind wichtige Inhibitoren der Blutplättchen, erhöhen dort die Konzentration von cAMP und cGMP, welche spezifische Effektor-Systeme in Blutplättchen regulieren. Dies sind unter anderem Phosphodiesterasen (PDEs) und die cAMP- sowie cGMP-abhängigen Proteinkinasen A (PKA) und G (PKG), welche zahlreiche Proteine phosphorylieren. Bis heute sind diese cAMP/PKA und cGMP/PKG Signalwege nur unvollständig verstanden. 1) In Kooperation mit dem ISAS in Dortmund wurde ein erstes quantitatives Phospho-Proteom von Blutplättchen erstellt, deren cGMP/PKG Signalwege selektiv stimuliert und mit dem Phospho-Proteom von Blutplättchen verglichen wurden, deren cAMP/PKA-Signalwege selektiv stimuliert wurden. Diese Ergebnisse werden zeitnah als Publikation eingereicht mit Elena Kumm als eine der Erstautorinnen. Bei dieser Analyse wurden mittels Massenspektrometrie einige neue und interessante Zielmoleküle von PKA/PKG in unbehandelten und mit Convulxin (GPVI) und Thrombin (PAR1/4, GPIbα) behandelten Blutplättchen identifiziert. Diese Proteine sollen nun mittels Immunoblotting/Phostag-Technologie sowie funktionellen Analysen validiert werden (AP 1).

2) Während ihrer Promotion und eines anschließenden CTH-TRP-Projekts konnte Elena Kumm die Proteine aus der Familie der cAMP-regulierten Phosphoproteine ARPP19 und α-Endosulfin (ENSA) als neue Substrate von PKA/PKG in humanen Blutplättchen charakterisieren. In sich teilenden Zellen (Zellen mit Zellkern) kontrollieren diese Proteine mit Hilfe der Ser/Thr-Kinase MAST(L) die Aktivität der Ser/Thr-Phosphatase PP2A und somit den Zellzyklus und die Phosphorylierung/Dephosphorylierung diverser Proteine. Blutplättchen besitzen weder einen Zellkern noch einen Zellzyklus, und trotzdem konnte Elena Kumm den MAST(L)-ENSA/ARPP19-PP2A Signalweg nachweisen. Bei Behandlung von Blutplättchen mit Substanzen, welche die cAMP- bzw. cGMP-Konzentration erhöhen, konnte eine Phosphorylierung der regulatorischen B56δ Untereinheit von PP2A nachgewiesen werden, was die PP2A Aktivität stimuliert und damit die Dephosphorylierung von Proteinen. Gleichzeitig wurde auch eine erhöhte ENSA S109/ARPP19 S104 Phosphorylierung zusammen mit einer Verminderung der ENSA S67-Phosphorylierung beobachtet, welche bestimmte PP2A Formen „enthemmt“. Geringe Mengen von Okadasäure (OA), einem globalen Inhibitor von PP2A, führen zu einer erhöhten Phosphorylierung von ENSA S67/ARPP19 S62, wodurch die Aktivität einer MASTL (oder ähnlichen) Kinase in humanen Blutplättchen nachgewiesen werden konnte. OA führt auch zu einer erhöhten Phosphorylierung von weiteren PP2A Effektoren wie VASP, Akt und den MAP-Kinasen p38 und Erk1/2 und reduziert die Thrombin-induzierte Blutplättchen-Aktivierung. Auch wenn nur pS62 ARPP19 PP2A in Blutplättchen blockiert, so sind doch beide rekombinanten Proteine, pS62 und pS104 ARPP19, Substrate von PP2A in Blutplättchen-Lysaten. Diese Ergebnisse sind auf dem Gebiet der reversiblen Proteinphosphorylierung in Blutplättchen Neuland und gerade zur Veröffentlichung eingereicht (Kumm E et al, manuscript in revision). Erste in vitro Untersuchungen mit PP2A B56δ-defizienten Mäusen zeigten nun eine erhöhte Blutplättchen-Adhäsion, Aggregation und Thrombusbildung an Kollagen-Oberflächen unter arteriellem Fluss (Kooperation mit J. Heemskerk, CARIM, Maastricht) und eine erhöhte Blutplättchen Integrin αIIbβ3-Aktivierung und α-Granula Freisetzung nach Thrombin-Stimulation, im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Wegen der großen Rolle gerade der PP2A-B56δ für die Regulation der Blutplättchen, will die Projektleiterin jetzt mit Blutplättchen von PP2A-B56δ defizienten- und Wildtyp-Mäuse im AP2 mittels Immunoblotting in vitro erforschen, ob PP2A-B56δ das Phosphorylierungsmuster von rekombinantem ENSA/ARPP19 in Maus-Blutplättchen beeinflusst. PP2A-B56δ-Effekte auf die Blutplättchen-Adhäsion, -Aggregation und Thrombusbildung in vivo untersuchen wir in Kooperation mit C. Reinhardt (CTH-Plattform ‚Intravital-Mikroskopie‘), unter Verwendung des Halsschlagader-Thrombose Modells bei PP2A-B56δ defizienten- und Wildtyp-Mäusen. Diese Daten sind wichtig für eine weitere, geplante Veröffentlichung über den PP2A-B56δ Signalweg in Maus-Blutplättchen, seinen Crosstalk mit PKA-/PKG-Signalwegen und dann für eine weitere geplante Drittmittelförderung.

Projektleitung

Dr. Kumm (geb. Walter)
Dr. Elena Kumm (geb. Walter)
Funktionen: Wissenschaftliche Mitarbeiterin

06131 17-8296
elena.kumm@unimedizin-mainz.de