Visual Universitätsmedizin Mainz

TRP X44 Mechanismen der transienten Syk-Phosphorylierung in Blutplättchen

Förderzeitraum: 01.03.2020 – 31.05.2020

Projektskizze

Syk (spleen tyrosine kinase) ist für die Aktivierung von Leukozyten/Immunzellen und Blutplättchen von zentraler Bedeutung, auch für viele onkologische, immunologische und vaskuläre Erkrankungen. In Blutplättchen wird Syk durch Adhäsionsrezeptoren wie GPIbα, GPVI, und CLEC-2 und nachgeschaltete Src-Family-Kinasen (SFKs) aktiviert. Eine vollständige Syk-Aktivierung erfordert die Phosphorylierung von mehreren Tyrosin-Stellen (durch SFKs und/oder Autophosphorylierung), was zur Bindung an das Adapterprotein ‘Linker of Activated T cells’ (LAT) in Membranen führt.  Phosphoproteomuntersuchungen haben ferner aufgezeigt, dass humanes Syk mit vielen regulatorischen Proteinen interagiert und an ~32 Stellen (Tyrosine, Serine/Threonine) phosphoryliert wird, sehr oft innerhalb der so wichtigen Syk-Interdomäne B. Es wird hier die Hypothese verfolgt, dass diese Effekte für die Syk-Aktivität und auch Bindung an andere Adapterproteine überaus wichtig sind. Kürzlich zeigte die Projektleiterin in ihrer Doktorarbeit und daraus resultierenden Publikationen, dass die selektive Aktivierung von GPIbα bzw. GPVI durch Echicetin Beads (EB) bzw. Convulxin eine Syk-abhängige intrazelluläre Ca2+ -Freisetzung sowie eine starke Thrombozytenaggregation stimuliert. Die GPIbα/GPVI-Aktivierung erhöhte sehr schnell eine Syk–Tyrosinphosphorylierung an Y525/526 (Aktivierungsmarker) und an Y352 (Verstärkung der Syk-Aktivierung), die aber transient waren. Erstmalig konnte auch eine durch verschiedene Plättchen-Agonisten stimulierte Syk S297-Phosphorylierung nachgewiesen werden, die sehr stark und ebenfalls transient war. Sowohl die Serin-Phosphorylierungsstelle (S297) als auch die schon erwähnte Tyrosinphosphorylierungsstelle (Y352) befinden sich in der Interdomäne B von Syk die durch Mutationsuntersuchungen und strukturbiologische Studien als allosterische Regulatorstelle der Syk identifiziert worden war. Deshalb werden auch die Interaktion von aktivierenden (GPIbα, GPVI) und hemmenden (cAMP/PKA, cGMP/PKG) Signalwegen auf die Blutplättchenaktivierung und Syk-Phosphorylierung untersucht. Während die etablierten hemmenden Signalwege in meinen Untersuchungen die Bluttplättchenaktivierung wie erwartet stark hemmten, war das nicht der Fall hinsichtlich der initialen Syk-Tyrosinphosphorylierung/-Aktivierung. Im Gegenteil, Syk wurde sogar vermehrt stimuliert. Auffallend, die GPIbα/GPVI-stimulierte Syk S297–Phosphorylierung wurde durch die PKA/PKG-Signalwege stark gehemmt. Anschließend wurde gezeigt, dass sowohl die PKA/PKG-Signalwege als auch eine PKC–Hemmung die GPVI- und GPIbα- stimulierte Syk Y525/526- und Y352-Phosphorylierung verstärken, die Syk S297-Phosphorylierung aber vollständig gehemmt wurde. Diese eindrucksvolle differentielle Syk-Antwort nach GPIbα/GPVI-Stimulation ist ein ganz neues Ergebnis, das auch in weiteren funktionellen Messungen bestätigt wurde. Ganz neuen Daten der Projektleiterin über die Regulation der für Blutplättchen/Immunzellen essentiellen Syk durch ein Netzwerk von sowohl Tyrosinkinasen als auch Serin/Threoninkinasen sind kürzlich in der Arbeitsgruppe Jurk publiziert worden und Grundlage für dieses Projekt. Während die Regulation von Syk durch Tyrosinkinasen (SFK, Syk) und Tyrosinphosphatasen (TULA-2) intensiv bearbeitet worden sind, ist hinsichtlich der Serin/Threonin-Proteinphosphatasen für Syk S297 nichts bekannt. Wegen der überaus eindrucksvollen Syk S297-Phosphorylierung /-Dephosphorylierung sollen in diesem Projekt jetzt die verantwortliche Phosphatase identifiziert und ihre Rolle für die Rekrutierung von Syk-Bindeproteinen sowohl mit humanem als auch murinen Blutplättchen bearbeitet werden. Diese Ergebnisse sind für eine weitere Publikation und für zukünftige Drittmittelantrage von großer Bedeutung.

Projektleitung

Dr. Makhoul
Dr. Stephanie Makhoul
Funktionen: Wissenschaftliche Mitarbeiterin

06131 17-8296
stephanie.makhoul@unimedizin-mainz.de