Teilprojekt 1 - Dr. Ernesto Bockamp / Dr. Leonid Eshkind

In vivo Charakterisierung von sensibilisiernden und protektiven Suszeptibilitätsfaktoren der Tumorgenese


Die häufigste Todesursache bei Krebspatienten ist die intrinsische oder erworbene Resistenz von Tumorzellen gegenüber der uns zur Verfügung stehenden Chemotherapeutika. Aus diesem Grund ist es von gro?er Bedeutung, Tiermodelle zu etablieren, welche die kontrollierte in vivo Erforschung der Initiation, Progression, Rezidivbildung und Therapie bisher unheilbarer Krebserkrankungen ermöglicht. Zentral hiefür ist einerseits die zelltyp-spezifische Deregulierung von promovierenden Suszeptibilitätsgenen in Krebsstammzellen (Konzept der cancer stem cell) und andererseits der selektive Schutz von normalen Zellen/Stammzellen mit Hilfe von protektiven Systemen. Um erstmalig den in vivo Effekt sowohl von tumor-promovierenden als auch stammzell-protektiven Suszeptibilitätsfaktoren in hämatopoietischen Stammzellen (HSZ)/leukämischen Stammzellen (LSZ) erforschen zu können, haben wir eine SCL knock-in Maus generiert. Mit Hilfe dieser tet on/off Maus soll der Wnt/b-Catenin Signalweg als auch die DNA-Reparaturenzyme O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (MGMT) und die apurine Endonuklease (Apn1) in LSZ/HSZ konditional/reversibel reguliert werden. Beide Subprojekte erforschen somit erstmalig in einem konditionalen Mausmodell die Bedeutung des leukämie-assoziierten Wnt Signalweges beziehungsweise die stammzell-protektive Wirkung von Reparaturfaktoren in HSZ.

Teilprojekt 3 - Prof. Dr. Bernd Epe

Bedeutung der oxidativen DNA Schädigung für die Tumorentstehung

 
Oxidative DNA-Modifikationen werden in allen Zellen und Geweben gefunden. Sie sind eine wichtige Quelle "spontaner" Mutationen und tragen deshalb vermutlich zur spontanen Krebsentste?hung bei. Entsprechend sollten Gene bzw. Faktoren, die die Bildung oder Reparatur oxidativer DNA-Modifikationen beeinflussen, wichtige "Suszeptibilitätsfaktoren" bei der Kanzerogenese darstellen. Ziel des Projektes ist es, diese Hypothese zu prüfen und zu ermitteln, durch welche endogenen Faktoren und Mechanismen einerseits die Bildung und andererseits die Reparatur der oxidativen DNA-Modifikationen massgeblich beeinflusst wird.
In der kommenden Antragsperiode soll die von uns nachgewiesene Rolle der Proteine CSB, PARP1 und XPA an der globalen Reparatur oxidativer DNA-Basenmodifikationen weiter aufgeklärt werden. Weiterhin soll der Einfluss des zellulären Redoxstatus auf die Reparatur ermittelt werden. Als mutmassliche Quellen oxidativer DNA-Schäden werden bestimmte Oxidasen des Zellkerns untersucht. Mit Hilfe der reparaturdefizienten Mäuse  soll schliesslich die Bedeutung der oxidativen DNA-Schädigung in einem Darmkrebsmodell und ihre Verhinderbarkeit durch zelluläre und exogene Antioxidantien geprüft werden.

Teilprojekt 4 - Prof. Dr. Gerhard Fritz

Zelluläre Antworten auf gentoxische Expositionen: DNA-schadensabhängige und DNA-schadensunabhängige Mechanismen

 
Zelluläre Antworten auf gentoxischen Stress können ihren Ursprung sowohl in DNA-schadensabhängigen als auch DNA-schadensunabhängigen Mechanismen haben. Diese Stress-Antworten werden innerhalb weniger Minuten bis Stunden nach Exposition aktiviert und determinieren über die Regulation der Genexpression, Zellzyklusprogression und DNA-Reparatur letztendlich Gentoxizität und Zytotoxizität. Unsere bisherigen Befunde zeigen, dass der Stimulation Stress-aktivierbarer Proteinkinasen (SAPK/JNK) nach Alkylantienexposition unterschiedliche Mechanismen zu Grunde liegen. Innerhalb der ersten zwei Stunden nach Exposition geht deren Aktivierung überwiegend auf DNA-schadensunabhängige Mechanismen zurück. Zu späteren Zeiten, d.h. > 2 h, hingegen sind die DNA-Reparaturproteine DNA-PKcs und CSB für eine anhaltende SAPK/JNK Aktivierung essentiell. Sowohl frühe als auch späte Stimulation von SAPK/JNK wird durch Statine sowie durch spezifische Rho-Inhibitoren verhindert. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass isoprenylierbare Proteine auch an der Regulation DNA-schadensabhängiger Mechanismen beteiligt sind. Zukünftig geplante Arbeiten sind: (i) die nähere Charakterisierung der DNA-PKcs und CSB-abhängigen Mechanismen die nach Alkylantienexposition zur Stimulation von SAPK/JNK führen; (ii) die Analyse der Relevanz spezifischer DNA inter- und intrastrand-cross-links als Initiatoren DNA-schadensabhängiger Signalmechanismen sowie (iii) die überprüfung der Hypothese eines "cross-talks" zwischen DNA-schadensabhängigen und DNA-schadensunabhängigen Signalmechanismen nach Genotoxin Exposition.

Teilprojekt 5 - Prof. Dr. Bernd Kaina / Dr. Wynand Roos

Einfluss von DNA-Repartur auf Genotoxin-Resistenz und Apoptose induziert durch alkylierende Agenzien


Alkylierende Agenzien, zu denen Umweltkarzinogene wie auch Zytostatika gehören, wirken zytotoxisch durch Induktion von DNA-Schäden, welche Apoptose auslösen können. Eine wichtige prä-apoptotische Läsion, die wir in Vorarbeiten identifiziert haben, ist O6-Methylguanin (O6MeG). Das Ziel des Projektes besteht darin, durch Verwendung reparaturdefekter Mutanten und Modulation der DNA-Reparatur (knockout, Hemmstoffe, siRNA) zu ermitteln a) wie O6MeG in eine apoptotische Läsion "prozessiert" wird und welche Rolle hierbei die DNA-Mismatch-Reparatur (MMR), die DNA-Replikation, die nicht-homologe Rekombination (HR) und das nicht-homologe Endjoining (NHEJ) spielen, b) wie von O6MeG/T Fehlpaarungs-Läsionen ausgehend im Zusammenhang mit MMR (MSH2, MSH6, MBD4) Apoptosewege eingeleitet werden und welche Rolle hierbei ATR, Chk1,2, p53, p73 sowie JNK, p38K, Caspase-2 und das Fas/CD95/Apo-1 System spielen, c) welchen Beitrag N-Alkylierungen zur Apoptoseinduktion haben und d) welches der Mechanismus der Apoptoseinduktion ausgehend von O6Chlorethylguanin-Läsionen in Lymphozyten und Glioblastom-Zellen ist. Des Weiteren wollen wir an MGMT, AAG (Alkylpurin-DNA-Glycosylase) und MGMT/AAG knockout-Mäusen prüfen, welchen Rolle O6MeG und N-Alkylierungen im Prozess der  Karzinogenese in vivo spielen.

Teilprojekt 6 - Dr. Beate Köberle

Cisplatin-induzierte DNA-Läsionen: Reparatur und Bedeutung für die Chemotherapie  


Cisplatin wird häufig als Chemotherapeutikum bei der Behandlung von metastasierenden Tumoren eingesetzt. Cisplatin induziert sowohl DNA-Intrastrang-Addukte als auch Interstrang-Crosslinks (ICL). Es ist jedoch nicht bekannt, welcher Schadenstyp hauptsächlich zur Toxizität von Cisplatin beiträgt. Dies soll im Rahmen des beantragten Projektes untersucht werden. Cisplatin wird besonders erfolgreich bei der Behandlung von metastasierenden Testis-Tumoren eingesetzt und führt zu Heilungsraten von über 75%. Durch Cisplatin induzierte DNA-Intrastrang-Addukte werden mittels Nukleotid-Exzisionsreparatur repariert. ICLs werden mittels Crosslink-Reparatur entfernt. Die Expression des an beiden Prozessen beteiligten Raparaturkomplexes ERCC1-XPF ist in Testis-Tumorzelllinien erniedrigt, und es soll untersucht werden, inwieweit diese Reduktion bei der beobachteten Sensitivität der Testis-Tumorzellen gegenüber Cisplatin eine Rolle spielt. Es soll dann geklärt werden, ob eine Reduktion dieses Reparaturkomplexes in Cisplatin-resistenten Blasen-Tumorzelllinien sowie in Zelllinien mit erworbener Cisplatinresistenz zu einer erhöhten Chemosensitivität führt. Schliesslich wird untersucht werden, wie ERCC1-XPF in normalen Geweben und in Tumoren exprimiert ist.

Teilprojekt 7 - Dr. Ekkerhart Lausch / Prof. Dr. Bernhard Zabel

Kooperative Schritte in der VHL-abhängigen Tumorentstehung


Die zentrale physiologische Funktion des Tumorsuppressors VHL ist durch viele Arbeiten gut dokumentiert: Im Komplex mit den Proteinen Elongin C, B und Cullin-2 reguliert pVHL als Adaptormolekül einer multimeren E3-Ubiquitinligase den proteosomalen Abbau der Trans-kriptionsfaktoren HIF-a und vermittelt darüber die zelluläre Adaptation an Veränderungen des Sauerstoffpartialdrucks. Wie pVHL als Tumorsuppressor wirkt, bleibt dagegen weit-gehend unverstanden. Auf Grundlage der Genotyp-Phänotyp-Korrelation des VHL-Syndroms ist es mit Hilfe einer knockin Strategie nun erstmals gelungen, einen VHL-assoziierten Tumor in der Maus zu erzeugen. Die detaillierte Analyse dieses in vivo-Modells der Phäochromo-zytomogenese wird zur Aufklärung der Tumorsuppressor-Funktion von VHL beitragen. Dagegen wurde durch gezielte Ausschaltung des murinen Vhl im proximalen Tubulus bisher kein Tumor induziert. Aus der vergleichenden Untersuchung beider Modellsysteme wird Aufschlu? über die Suszeptibilität für eine VHL-abhängige Tumorentstehung erwartet. Im Rahmen der Forschergruppe werden Kooperationsprojekte die Rolle der DNA-Reparatur und der endogenen oxidativen DNA-Schädigung nach konstitutiver Stabilisierung von HIF-a in der Karzinogenese untersuchen. Die entwickelten Tiermodelle können ausserdem zur in vivo-Analyse HIF-abhängiger Faktoren in der Pathogenese des Kolitis-assoziierten Kolon-karzinoms dienen.

Teilprojekt 8 - PD. Dr. Martin Schuler

Alternative Tumorsuppressionsmechanismen bei Bronchialkarzinomen - Molekulare Charakterisierung und Möglichkeiten der therapeutischen Modulation  


Nach heutigem Verständnis kommt es während der Entstehung und Progression nicht-kleinzelliger Bronchialkarzinome regelmässig zu einer Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen. Wichtige Tumorsuppressoren sind hierbei die Genprodukte der INK4A- und TP53-Loci, welche, nach Aktivierung durch Onkogene oder DNS-Schädigung, Zellzyklusarrest, DNS-Reparatur oder Apoptose regulieren. Entsprechend führt ein Funktionsverlust dieser Tumorsuppressoren zu dereguliertem Wachstum und zu Resistenz gegenüber Tumortherapien. Diesen uniformen Mechanismen steht jedoch eine hohe Variabilität des klinischen Verlaufs und der Therapiesensitivität nicht-kleinzelliger Bronchialkarzinome gegenüber. Eine der möglichen Ursachen hierfür kann in einer differentiellen Deregulation alternativer Tumorsuppressoren liegen. Ziel dieses Teilprojektes ist daher, experimentelle Modelle zur funktionellen Charakterisierung potentieller Tumorsuppressorgene bei nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen zu etablieren. Damit soll einerseits der tumorsuppressive Mechanismus der jeweiligen Genprodukte auf zellulärer und molekularer Ebene identifiziert werden; andererseits wird deren mögliche pathophysiologische Bedeutung in Bezug auf überleben, Proliferation, Metastasierung und Therapiesensitivität nicht-kleinzelliger Bronchialkarzinome in vitro und in vivo untersucht. Das Projekt fokussiert zunächst auf die Gene RASSF1A, ein potentieller Zellzyklusregulator, und BECN1, einen Regulator der Makroautophagie. Neben der Untersuchung des Wirkmechanismus der jeweiligen Genprodukte sowie deren Funktion im Kontext von DNS-Schädigung und -Reparatur soll hiermit beispielhaft die Grundlage für eine systematische und umfassende Identifikation alternativer Tumorsuppressionsmechanismen bei nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen geschaffen werden. 

Teilprojekt 9 - Dr. Stefan Wirtz / PD. Dr. Christoph Becker / Prof. Dr. Markus Neurath

TH2 Zytokine in der Pathogenese des Colitis-assoziierten Colonkarzinoms: Molekulare und immuntoxikologische Untersuchungen


Colitis ulcerosa (CU) und Morbus Crohn sind chronisch verlaufende Entzündungserkrankungen des Darmtrakts. Nur bei der CU besteht jedoch ein deutlich erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines Colonkarzinoms (CRC). In Voruntersuchungen haben wir in einem murinen Azoxymethan/DSS Modell des Colitis-assoziierten CRC mittels Mikroarraystudien Genexpressionsprofile von Tumorgewebe erstellt und analysiert. Dabei zeigte sich, dass insbesondere Rezeptoren der Typ2 Immunantwort (IL-4, IL-13, IL-33R (T1/ST2)) im Tumorgewebe im Vergleich zu anderen Zytokinrezeptoren überrepräsentiert waren. Interessanterweise, haben neuere Studien bei Patienten gezeigt, dass TH2 Antworten vermutlich entscheidend an der Immunpathogenese der CU beteiligt sind. Zusammengenommen implizieren diese Daten, dass TH2 Zytokine in Kombination mit entzündungsabhängigem oxidativem Stress synergistisch zu Tumorinduktion und -promotion führen. Die Rolle TH2 mediierter Signalwege im Rahmen der Entstehung des colitisassoziierten CRC ist bisher noch nicht bekannt und soll im Rahmen dieses Projektes untersucht werden. Hierzu soll neben dem AOM/DSS Modell des CAC auch als Vergleich das APCmin Mausmodell des sporadischen CRC untersucht werden. 

Z-Projekt - Dr. Ernesto Bockamp / Dr. Leonid Eshkind

Ergänzungsprojekt zur Versuchstierhaltung und Generierung von transgenen und knock-down Mausmodellen


Integraler Bestandteil der Forschergruppe sind Tiermodelle zur in vivo Erforschung von Suszeptibilitätsfaktoren der Tumorgenese. Diese Tiermodelle ergänzen die in vitro und in silico gewonnenen Daten und ermöglichen die in vivo Validierung von Erkenntnissen und Arbeitshypothesen. Hierbei werden einerseits Inzuchtstämme (Ratten und Mäuse) verwendet als auch genetisch veränderte und auf die spezifische Fragestellung adaptierte Mausmodelle (transgene, knock-out und knock-down Varianten). In der kommenden Förderungsperiode wollen wir im Rahmen dieses Z-Projektes die Haltung, Versuchsdurchführung, Generierung und experimentelle Testung dieser Tiermodelle zusammenfassen und so die notwendige finanzielle und logistisch-organisatorische Grundlage zur Durchführung dieser in vivo Versuchsreihen schaffen.