Einleitung

Die Durchflusszytometrie (FACS steht für Fluorescence Activated Cell Sorting) ermöglicht das Zählen und die Analyse von physikalischen und molekularen Eigenschaften von Partikeln (Zellen, Kunststoffkügelchen usw.) in einem Flüssigkeitsstrom. Eine Hauptanwendung besteht darin, mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben (Antikörper, Rezeptoren, Streptavidin, usw.) bestimmte Eigenschaften von Zellen oder Zellpopulationen auf Einzelzellebene zu dokumentieren.

Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern durchgeführt wird. Zur Analyse werden die Zellen einer Einzelzellsuspension durch hydrodynamische Fokussierung wie an einer Perlenkette an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet (Bild 1). Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen Laserstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben. Nach dem Laserpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen) auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die emittierte Photonenkonzentration, die durch einen Photodetektor registriert wird, verhält sich proportional zur Menge an gebundenen Antikörpern/ Zelle. Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und �streuung Informationen über die Zellgrösse und die Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas, Grösse des Zellkerns usw.) der Zellen gewonnen.
Eine gleichzeitige FACS-Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen Wellenlänge anregen lassen aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff charakteristische Emmissionsspektren verfügen (Beispiele siehe Tab. 1).

Tab. 1: Auswahl von Absorptions- und Emmissionsmaxima von häufig in der Durchflusszytometrie eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen

Spectra Viewer: Animation verschiedener Absorptions- und Emmissions-Spektren
  

Bild 1: Schematische Abbildung der Quarzküvette eines FACScan-Gerätes (a) mit hydrodynamischer Fokussierung (b).

Die Anwendungen (kein Anspruch auf Vollständigkeit)

Zu den häufigsten Anwendungen zählt, wie schon weiter oben erwähnt, durch Fluoreszenzfarbstoff-markierte monoklonale Antikörper die Expression von Oberflächen- bzw. intrazellulären Molekülen auf Einzelzellebene zu detektieren. Mit Hilfe von RNA/DNA-Farbstoffen lassen sich Zellzyklus-Analysen und Apoptoseassays durchführen. Ausserdem gibt es Fluoreszenzfarbstoffe, die eine Analyse des intrazellulären pH-Wertes und den Ionenfluss an Zellmembranen erlauben. Immer weiter verbreitet wird der Einsatz von Farbstoffen, die direkt von den Zellen produziert werden, wie GFP (Green Fluorescent Protein) und dsRed. Damit lässt sich z.B. die Transfektionseffizienz kontrollieren oder die Transkription eines Gens in der lebenden Zelle nachweisen.  

Protokolle zum Downloaden gibt es hier.

Die FACS Core Facility (FacsLab) der Universität Mainz

In unserem Labor stehen folgende Geräte für durchflusszytometrische Anwendungen zur Verfügung (Anmeldung bzw. Reservierung notwendig):

FACS-Calibur:

Dieses Analysegerät ist mit einem Argonlaser (488 nm) und einer roten Laserdiode (633 nm) ausgestattet und ermöglicht die gleichzeitige Analyse von bis zu vier Farben (Bild 2).

Die Analyse der Proben kann nach Einweisung durch den Operator selbstständig vom jeweiligen Experimentator durchgeführt werden. Infos unter Tel.: 06131 39 30219.

FACS-Vantage SE:

Dieses, durch einen Operator betriebene Gerät ist mit zwei/ drei Lasern ausgestattet (Argonlaser, HeNe-und UV-Laser) und ermöglicht eine 4-6 Farben-Analyse, sowie das Sortieren von Partikeln mit gewünschten Eigenschaften (Bild 3).

DNA-Chip-Array-Scanner:

Für das Einlesen und Auswerten von DNA-Chip-Arrays steht ausserdem ein Affymetrix 428 Array Scanner zur Verfügung.

Bild 2: Schematische Darstellung des Strahlenganges eines FACScan-Gerätes

Bild 3: Schematische Darstellung eines Sortvorgangs von markierten Zellen

Geschichtliches zur Durchflusszytometrie

Die Grundlagen für die Durchflusszytometrie so wie wir sie heute kennen wurden 1949 von Wallace Coulter gelegt. Er beantragte ein Patent zur Zählung von gelösten Partikeln und erleichterte damit die Leukozytenzählung bei der Blutanalyse. Ein weiterer Meilenstein war die Entdeckung des Prinzips der hydrodynamischen Fokussierung durch Van Dilla. Vorangetrieben durch die rasanten Entwicklungen in der Laser- und Computertechnik wurden Geräte entwickelt, wie wir sie heute als moderne Durchflusszytometer kennen. Diese leistungsfähigen Instrumente erlauben standardmässig die Analyse und Sortierung von 5000 Partikeln pro Sekunde. Die Geschwindigkeit kann unter Umständen mit Zusatzausstattung auf 20.000 Partikel pro Sekunde und mehr gesteigert werden. Dabei können bis zu 7 Parameter gleichzeitig analysiert und verarbeitet werden. Neue Hochleistungs-Sorter bringen es bei 10 Parametern sogar auf 70.000 Partikel pro Sekunde.

Literatur

Darzynkiewicz, Z., Robinson, J.P., Crissman, H.A. Flow Cytometry. 2nd Edition. 1994. Academic Press: San Diego

Radbruch, Andreas. Flow Cytometry and Cell Sorting. 2000. Springer Verlag: Heidelberg

Shapiro, Howard M. Practical Flow Cytometry 4th Edition. 2003. Wiley-Liss: New York