Regulation der DNA-Reparatur nach genotoxischen Noxen

Zellen sind im Laufe ihres Lebens sowohl endogenen als auch exogenen Stressfaktoren ausgesetzt. Zu diesen Faktoren gehören DNA-schädigende Stimuli wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung, oxidativer Stress und chemische Mutagene. Um die DNA vor diesen Substanzen zu schützen, haben sich im Laufe der Evolution unterschiedliche DNA Reparatursysteme entwickelt, die sowohl der toxischen als auch der mutagenen Wirkung der DNA-Schädigung entgegen wirken.  Eine Übersicht über die unterschiedlichen Reparatursysteme der menschlichen Zelle wurde von uns kürzlich veröffentlicht.

Christmann M, Tomicic MT, Roos WP, Kaina B. (2003) Mechanisms of human DNA repair: an update. Toxicology 193(1-2), 3-34.

Im Zentrum unseres Interesses steht die Frage, wie Zellen auf die Behandlung mit unterschiedlichen mutagenen Agenzien reagieren und ob diese Behandlungen unterschiedliche Reparatursysteme aktivieren. Die Regulation der DNA-Reparatur kann über unterschiedliche molekulare Mechanismen erfolgen. Hierzu gehören die transkriptionelle Induktion von Genen, die Ab- und Anschaltung von Genen mittels Methylierung, die Translokation von Proteinen und die posttranslationale Modifizierung.

Im Laufe unserer Untersuchungen konnten wir zeigen, dass es nach Behandlung mit alkylierenden Agenzien zu einer Translokation der an der Fehlpaarungsreparatur beteiligten Gene MSH2 und MSH6 aus dem Zytoplasma in den Zellkern kommt. Zusätzlich konnte eine Phosphorylierung dieser Proteine nachgewiesen werden. Auch bei der Behandlung von Tumorzellen kommt es zu einer Veränderung der Reparaturkapazität.

Christmann M, Tomicic MT, Kaina B. (2002) Phosphorylation of mismatch repair proteins MSH2 and MSH6 affecting MutSalpha mismatch-binding activity. Nucleic Acids Res. 30(9), 1959-66.

Christmann M, Kaina B (2000) Nuclear translocation of mismatch repair proteins MSH2 and MSH6 as a response of cells to alkylating agents. J Biol Chem. 2000 275(46), 36256-62.

Transkriptionelle Regulation von DNA-Reparaturgenen

Wie bereits erwähnt, reagieren Zellen auf gentoxischen Stress mit dem transkriptionellen An- und Abschalten bestimmter Gene. Zu den Genen, welche direkt nach der DNA-Schädigung induziert werden, gehören die Protoonkogene der fos/jun Familie und das Tumorsuppressorprotein p53. Die korrespondierenden Proteine können ihrerseits als Transkriptionfaktoren die Induktion weiterer Gene induzieren. Zu diesen Genen gehören die MGMT und APE, für welche wir bereits eine Induktion nach Behandlung mit genotoxischen Agenzien nachweisen konnten. Fibroblasten, welche defizient f�r c-Fos und p53 sind, reagieren hypersensitiv hinsichtlich der clastogenen, zytotoxischen und Apoptose-induzierenden Wirkung von UV-Licht und Alkylantien.

Es stellt sich nun die Frage, ob diese Hypersensitivität der c-fos- oder p53-defizienten Zellen auf einer fehlenden Induktion von DNA-Reparaturgenen und damit auf einem Defekt in der DNA-Reparatur beruht. Das Ziel des aktuellen Projektes besteht zum einen in der Aufklärung dieser Frage und zum anderen in der Identifikation von DNA-Reparaturgenen, welche durch Behandlung mit UV-C Licht induziert werden, und für die Hypersensitivität oder den Reparaturdefekt dieser Zellen verantwortlich sind.

Im Rahmen dieser Untersuchungen werden customized DNA-Microarrays eingesetzt, welche Proben von allen bekannten DNA-Reparaturgenen und Replikations-assoziierten Genen enthalten. Diese Untersuchungen zeigten die p53-abhängige Induktion der Flap Endonuklease 1 (Fen1). überexpression von Fen1 führt zur verstärkten Wiederaufhebung des Replikationsblocks und könnte daher die Zugänglichkeit der UV-C induzierten Läsionen erhöhen, was zu verstärkter Reparatur und erhöhter Resistenz führen würde.

Christmann M, Tomicic MT, Origer J, Kaina B. (2005) Fen1 is induced p53 dependently and involved in the recovery from UV-light-induced replication inhibition. Oncogene. 24(56):8304-13.

Nikolova T, Christmann M, Kaina B. (2009) FEN1 is overexpressed in testis, lung and brain tumors.  Anticancer Res. 29(7):2453-9.

In weiteren Untersuchungen konnten wir die c-Fos-abhängige Induktion von Xeroderma pigmentosum group F (XPF) nachweisen. überexpression von XPF führt zur verstärkten Entfernung von UV-C induzierten DNA-Schäden (CPDs) und verstärkt hierüber die Nukleotidexzissionsreparatur.

Christmann M, Tomicic MT, Origer J, Aasland D, Kaina B. (2006) c-Fos is required for excision repair of UV-light induced DNA lesions by triggering the re-synthesis of XPF. Nucleic Acids Res. 2006;34(22):6530-9.

Christmann M, Tomicic MT, Aasland D, Kaina B. (2007) A role for UV-light-induced c-Fos: Stimulation of nucleotide excision repair and protection against sustained JNK activation and apoptosis. Carcinogenesis. 2007 Jan;28(1):183-90.

Gefördert durch die DFG.

p53: Resistenzmarker gegen aklylierende Agenzien

Eines der bekanntesten Resistenzmarker gegenüber genotoxischen Stress ist p53. So kann p53 einerseits über die Regulation von DNA-Reparaturgenen protektiv oder über die Induktion von aopototischen Proteinen wie dem FasR oder Puma und Noxa sensitivierend wirken. In unseren Arbeiten konnten wir zeigen, dass p53 in Glioblastomzellen nach Temozolomidbehandlung über Induktion der Apoptose (via FasR) ein sensitivierender Marker und nach Behandlung mit ACNU über Induktion der NER-Proteine XPC und DDB2 ein protektiver Marker ist.

Naumann SC, Roos WP, Jöst E, Belohlavek C, Lennerz V, Schmidt CW, Christmann M, Kaina B.(2009) Temozolomide- and fotemustine-induced apoptosis in human malignant melanoma cells: response related to MGMT, MMR, DSBs, and p53. Br J Cancer. 100(2):322-33.

Batista LF, Roos WP, Christmann M, Menck CF, Kaina B. (2007) Differential sensitivity of malignant glioma cells to methylating and chloroethylating anticancer drugs: p53 determines the switch by regulating xpc, ddb2, and DNA double-strand breaks. Cancer Res. 67(24) 11886-95

Ein DNA-Reparaturprotein welches sich bereits in der klinischen Routine als Resistenzmarker durchgesetzt hat ist die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT), ein DNA-Reparaturprotein, welches Alkylierungen von der O6-Position des Guanins entfernt. Diese Schäden sind bei der Therapie mit dem methylierenden Zytostatikum Temozolomid und den chloroethylierenden Zytostatika ACNU, CCNU und Fotemustin  für die Zytotoxitität verantwortlich, weshalb MGMT als Biomarker für Tumortherapie angesehen werden kann und  in Gehirntumoren mit dem klinischen Ansprechen der Therapie korreliert.

Kaina B, Christmann M, Naumann S, Roos WP. (2007) MGMT: key node in the battle against genotoxicity, carcinogenicity and apoptosis induced by alkylating agents. DNA Repair (Amst). 206(8):1079-99.

Ein wichtiger Mechanismus über den die MGMT reguliert wird ist die Methylierung des Promotors. Hierbei kann man zwei verschiedene Möglichkeiten unterscheiden. Die Methylierung des Genkörpers, also des kodierenden Bereichs des Gens, führt zu einer Steigerung der MGMT-Aktivität. Dies konnte von uns bei der Untersuchung von Melanomzellen beobachtet werden und stellt den Mechanismus dar über welchen diese Zellen Resistenz gegenüber dem Zytostatikum Fotemustin entwickelt haben.

Christmann M, Pick M, Lage H, Schadendorf D, Kaina B. (2001) Acquired resistance of melanoma cells to the antineoplastic agent fotemustine is caused by reactivation of the DNA repair gene MGMT. Int J Cancer. 92(1):123-9.

Die Methylierung des Promotors führt im Gegensatz zur Methylierung des Genkörpers zu einer Reduktion der MGMT-Aktivität und wird momentan in der Klinik mittels der Methylspezifischen PCR (MSP) als Standard zur Detektion von MGMT in Tumoren verwendet.

Christmann M, Nagel G, Horn S, Krahn U, Wiewrodt D, Sommer C, Kaina B. (2010) MGMT activity, promoter methylation and immunohistochemistry of pre-treatment and recurrent malignant gliomas: A comparative study on astrocytoma and glioblastoma. Int J Cancer. in press

Gefördert durch die DFG und Mildred Scheel Stiftung