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Arbeitsgruppe Angewandte Molekularbiologie

Das Ziel der ERC Advanced Investigator Gruppe von Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. Werner E.G. Müller, die auch die Gruppen von Frau Prof. Dr. Xiaohong Wang, Prof. Dr. Dr. Heinz C. Schröder und Dr. Matthias Wiens umfasst, ist es, neue Erkenntnisse in der Grundlagenforschung zu gewinnen, die in eine medizinische Anwendung überführt werden können.

Von Biomolekülen zu Biomineralen: Evolution medizinisch relevanter Stoffwechselwege

Ausgangspunkt unserer gegenwärtigen Forschungsarbeiten sind unsere langjährigen Untersuchungen der Sekundärmetabolite von Schwämmen, eine der reichhaltigsten Quellen für neuartige, potenziell medizinisch anwendbare Substanzen im Meer. Hierbei gelang es uns unter anderem einen Inhibitor der Herpes simplex Virus DNA-Polymerase aufzufinden und dessen Mechanismus aufzuklären: araA, ein Virostatikum, das bis heute in klinischem Gebrauch ist. Ebenso konnte der Wirkmechanismus eines weiteren Nucleosid-Analogons, araC, geklärt werden, das in der Tumortherapie eingesetzt wird. Im Laufe dieser Arbeiten wurden von uns in Schwämmen Stoffwechselwege und Mechanismen, wie Apoptose, entdeckt und untersucht, die nicht nur bei diesen Tieren vorkommen, was dazu führte, dass von uns auch die molekularen Grundlagen der Zelltods bei humanen Krankheiten, wie Morbus Alzheimer, HIV und Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung, sowie der protektive Effekt bestimmter Arzneistoffe, wie Memantine und Flupirtin, geklärt werden konnte. Dabei wurde es immer deutlicher, dass die grundlegenden Stoffwechsel- und Stress-Response-Mechanismen bei Schwämmen ähnlich denjenigen bei Menschen sind. Dies führte letztendlich zu der Entdeckung, dass alle Tiere monophyletischen Ursprungs sind. Der Nachweis basierte auf unseren Ergebnissen eines umfangreichen Projektes zur Sequenzierung des exprimierten Schwammgenoms und erforderte zur Untersuchung der Stoffwechselwege die Etablierung einer bis dahin noch nicht vorhandenen Methode zur Schwammzell-Kultivierung („Primmorphe“). Ein Stoffwechselweg blieb jedoch unerklärbar: die Bildung des Mineral-Skeletts der Schwämme. Überraschenderweise zeigte ein Vergleich mit anderen Organismen wie dem Menschen, dass die molekularen biochemischen Prozesse, die der Biomineralisation – einem basalen Prozess in fast allen Tieren – zugrunde liegen, noch weitgehend unbekannt waren. Dieser Prozess, dem wir uns im Folgenden zuwandten, fesselt unser Forschungsinteresse bis heute.

Biomineralisation – ein Enzym-katalysierter Prozess?

Eine grundlegende Frage ist: Wie schaffen es Skelett-bildende Organismen, die Aktivierungsenergie zu überwinden, die auch bei Mineralisationsprozessen aufgebracht werden muss? So sind beispielsweise Tiefseeschwämme in der Lage, ihr Silikat-, also Glas-Skelett, bei Temperaturen nahe dem Gefrierpunkt zu bilden, obwohl die technische Glas-Herstellung Temperaturen von über 1000°C erfordert. Aus der Biochemie wissen wir, dass Enzyme die Aktivierungsenergie chemischer Reaktionen herabsetzen. Deshalb fragten wir: Ist auch die Silikat-Bildung enzymkatalysiert? In der Tat konnte dies von uns gezeigt werden. Das Schwamm-Protein Silicatein besitzt, wie wir zeigen konnten, die Fähigkeit, Silica (also ein anorganisches Material) über einen enzymatischen Mechanismus aus Orthosilikat (ebenfalls ein rein anorganisches Material) zu synthetisieren. Eine derartige Reaktion war bis dahin bei keinem anderen Enzym nachgewiesen worden – eine bahnbrechende Entdeckung, die in einem ERC Advanced Grant Projekt („BIOSILICA“) des Arbeitsgruppenleiters im Detail untersucht wurde und sich nicht nur für technische (Silica ist ein Grundmaterial der Nanotechnologe), sondern auch für medizinische Anwendungen von großer Bedeutung erwies.

From Gene to Enzyme to Inorganic Polymer
Genetisch kontrollierte Bildung des Silikat-Skeletts der Kieselschwämme über die Expression von Silicatein. Oben: Mechanismus der Silicatein-Katalyse. Unten links: Kontrollierte Bildung einer Schwamm-Silikat-Spicula (Skelett-Element) um ein zentrales Silicatein-Axialfilament. Unten rechts: Tiefseeschwamm.

Als nächstes fragten wir: Ist auch die Bildung des Calciumcarbonat-Skelettes der – evolutionär jüngeren – Kalkschwämme enzymkatalysiert? Auch dies konnte bejaht werden – das Enzym: eine Carboanhydrase.  Aufbauend auf den mit Schwämmen erhaltenen Ergebnissen stellten wir uns jetzt die Frage: Ist auch die Bildung des menschlichen Knochen-Minerals, des Hydroxylapatits (ein Calciumphosphat-Mineral), enzymkatalysiert und, falls so: Kann diese Erkenntnis einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese und möglicherweise zur Therapie von humanen Knochenerkrankungen liefern? Die Antwort brachte einen Paradigmenwechsel. Wir fanden, dass bei der Knochen-Mineralisierung initial nicht Hydroxylapatit, sondern amorphes Calciumcarbonat (ACC) gebildet wird, synthetisiert durch eine Carboanhydrase. Dieses wird anschließend durch Carbonat-Phosphat-Austausch in amorphes Calciumphosphat  (ACP) und dann Hydroxylapatit umgewandelt. Das benötigte Phosphat wird – wiederum enzymatisch – durch die Hydrolyse anorganischer Polyphosphate (PolyP), katalysiert durch die alkalische Phosphatase (ALP), das Schlüsselenzym der Osteoblasten, geliefert.

Schritte während der menschlichen Knochenbildung
Schritte während der menschlichen Knochenbildung.

Darüber hinaus fanden wir: Nur die amorphe Biominerale (ACC, ACP sowie auch Silica und PolyP – als Nano-/Mikropartikel), nicht deren kristallinen Formen, sind biologisch, regenerativ aktiv – eine Entdeckung, die neue Strategien für das Tissue Engineering und neue potenzielle therapeutische Targets (ACC, ACP, PolyP) bei Knochenerkrankungen eröffnete.

Geweberegeneration: Wer liefert extrazellulär die Energie?

Scaffolds/Matrizes, die für eine Geweberegeneration/-reparatur geeignet sind, müssen den eingewanderten Stammzellen eine geeignete Nische bieten, die es ihnen ermöglicht zu proliferieren und zu funktionell aktiven Geweben/Zellen zu differenzieren. Im besten Fall sind Materialien, die zu ihrer Herstellung benutzt werden, schon selbst regenerativ, ohne einen Zusatz von Zytokinen/Wachstumsfaktoren zu benötigen – genau diese Vorrausetzung erfüllen unsere amorphen Biomineralen. Es besteht aber noch eine zweite Vorrausetzung, die bisher kaum beachtet und ungelöst blieb: der Bedarf an metabolischer Energie. Dies betrifft, insbesondere schlecht durchblutete, bradytrophe Gewebe wie Knorpel mit nur wenigen Zellen und einer ausgedehnten extrazellulären Matrix. Eine extrazelluläre Energiequelle war bisher unbekannt – ATP, der universelle Energieträger, wird nur in minimalen Mengen aus Zellen freigesetzt. Wir fragten deshalb: Woher kommt diese Energie, wer liefert sie? Die Antwort ist: PolyP. Diese Polymere, die aus zahlreichen, über energiereiche Phosphoanhydrid-Bindungen miteinander verknüpften Phosphatresten bestehen, stellen nicht nur eine Phosphatquelle für die Knochenmineralisation dar, sondern dienen, wie wir fanden, generell als extrazellulärer Speicher und -Donor metabolischer Energie. Bei ihrer Hydrolyse wird ein Vielfaches der freien Energie der ATP-Hydrolyse frei. Wir konnten zeigen, dass die in PolyP gespeicherte Energie extrazellulär in biochemisch nutzbare Energie, in Form von ATP, umgewandelt werden kann, über die kombinierte Wirkung zweier Enzyme, der zellmembranständigen ALP und der Adenylatkinase (ADK).

PolyP: Energy storage and Energy release
PolyP als Energie-Donor im Extrazellularraum. Links: Der durch das Enzym Alkalische Phosphatase (ALP) katalysierte, schrittweise Abbau von PolyP ist stark exergonisch. Die freigesetzten Energie der Phosphoanhydridbindung kann entweder in Form von Wärme abgeführt oder zur Synthese von ATP verwendet werden, das dann für energieverbrauchende Prozesse (Bespiel: Knorpelbildung und Zellmigration/Mikrovaskularisation) verfügbar ist. Rechts: Bei der vollständigen Hydrolyse von PolyP (Beispiel: PolyP mit einer Kettenlänge von 40) wird eine Vielfaches der freien Energie der Hydrolyse von ADP oder ATP frei.
Spaltung der energiereichen Phosphoanhydridbindungen von PolyP
Spaltung der energiereichen Phosphoanhydridbindungen von PolyP (komplexiert mit Mg-Ionen) und Phosphotransfer zu AMP, katalysiert durch die kombinierte Wirkung der zellmembrangebundenen alkalischen Phosphatase (grün) und Adenylatkinase (blau), mit dem Ergebnis der Bildung von ATP im Extrazellularraum.

Entwicklung medizinischer Anwendungen

Die von uns entwickelten amorphen anorganischen Biomaterialien bieten somit optimale Vorrausetzungen für eine Anwendung in der regenerativen Medizin. Sie sind nicht nur regenerativ aktiv und bioabbaubar, sondern dienen, im Falle von PolyP, auch als Energielieferant – eine außergewöhnliche Eigenschaftskombination, die bisher von keinem anderen Material für das Tissue Engineering/Gewebereparatur gezeigt wurde.  Mit Hilfe eines bioinspirierten Verfahrens unter Verwendung unterschiedlicher divalenter Metallionen (Gegenionen) gelang es uns, amorphe (nicht-kristalline, also biologisch aktive) Nano- und Mikropartikel des PolyP mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften herzustellen. Diese Nano-/Mikropartikel sind stabil und werden nach Umwandlung in ein Koazervat in Gegenwart von proteinhaltigen Körperflüssigkeiten (z.B. Wundsekret) biologisch aktiv: so zeigen beispielweise Ca-PolyP-Nano-/Mikropartikel nach Koazervatumwandlung eine stark stimulierende Wirkung auf die Knochen-Mineralisation.

PolyP-basierte Nano-/Mikro-Biomaterialien
PolyP-basierte Nano-/Mikro-Biomaterialien. Links: Herstellung von amorphen Nano-/Mikropartikeln aus PolyP mit verschiedenen Kationen für die Wundheilung und Knorpelregeneration (Mg-PolyP) sowie die Knochenregeneration (Ca-PolyP) und Mineralisierung (Sr-PolyP). PolyP kann auch als "Käfig" zur Einkapselung von Arzneimitteln dienen, z.B. zur Behandlung von Knochentumoren und Metastasen. Rechts: Anwendung verschiedener Materialien auf PolyP-Basis im Tissue Engineering.

Durch Kombination von PolyP oder PolyP-Nano-/Mikropartikeln mit Hydrogel-bildenden Polymeren wie Alginat, Hyaluronsäure, Chitosanderivaten oder Chondroitinsulfat konnten von uns – u.a. auch 3D-druckbare – Hybridmaterialien für eine Reihe medizinischer Anwendungen entwickelt werden, von der Zahnversiegelung bis zu Wundheilungsmaterialien, zur Stimulierung der Mikrovaskularisation und Knochen- und Knorpel-Regeneration, sowie zur Herstellung künstlicher Blutgefäße und Korneas. Auch gelang es mit geeigneten Hydrogelen eine PolyP-basierte Bio-Tinte für den 3D-Zelldruck (3D-Bioplotting) zu entwickeln – die eingebetteten Zellen blieben proliferativ aktiv. Erste regenerativ aktive Implantatmaterialien wurden bereits im Tierversuch getestet und sollen in die klinische Anwendung gebracht werden.

3D-gedrucktes Polycaprolacton (PCL)-Scaffold
3D-gedrucktes Polycaprolacton (PCL)-Scaffold (A und B) und Scaffold, das mit PCL/Ca-PolyP-Mikropartikeln hergestellt wurde (B und D). Die Adhäsion und das Wachstum von SaOS-2-Zellen an dem PCL-Scaffold (E und F) und dem PCL/Ca-PolyP-MP-Scaffold sind gezeigt (G und H). Färbung mit Calcein für lebende Zellen (E und G) und mit DRAQ5 für die Gesamtzellzahl (F und H).

Neben diesen im Rahmen von drei ERC-Proof-of-Concept-Grants ("Si-Bone-PoC", "MorphoVES-PoC" und "ArthroDUR") und einer Reihe weiterer von uns koordinierter EU Projekten geförderten Arbeiten werden von uns gegenwärtig in einem deutsch-chinesischen Projekt neuartige Wundheilungsmaterialien, insbesondere für schwer heilende, chronische Wunden entwickelt.  Wie andere regenerative Prozesse erfordert die Wundheilung viel Energie – ein Bedarf, der durch die PolyP-Komponente dieser Materialien gedeckt wird.  Darüber hinaus induziert PolyP die Mikrovaskularisation. Weitere Forschungsarbeiten in einem laufenden EU Horizon 2020 Projekt („InnovaConcrete“) nutzen die stabilisierende Eigenschaft von PolyP auf ACC, um Zementen (sowohl technischen als auch medizinisch anwendbaren) selbstheilenden Eigenschaften zu verleihen. Auch konnten wir kürzlich in Modell-Systemen zeigen, dass PolyP potenziell protektiv gegenüber dem Coronavirus SARS CoV-2 wirkt.

Künstliche Blutgefäße
Künstliche Blutgefäße. (A) Herstellungsverfahren. Das Hydrogel wird durch einen Extruder in eine Ca-haltige Härtungslösung gepresst. (B bis D) Auf den Gerüsten gewachsene Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC). Färbung mit DRAQ5 (blaue Fluoreszenz) und Actin-Antikörpern (rot).