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Forschungsgebiete

Metabolische Resistenzmechanismen in malignen Tumoren

Projektübersicht:

Maligne entartete Zellen können der körpereigenen Abwehr sowie therapeutischen Angriffen entkommen und letztlich den Tod der betroffenen Patienten herbeiführen. Neben anderen Ursachen ist diese immunologische und therapeutische Resistenz in Besonderheiten des Tumorstoffwechsels begründet. So weisen bösartige Krebszellen häufig einen erhöhten Glukoseumsatz bzw. eine hohe Glykolyseaktivität auf und produzieren mehr oder weniger große Mengen an Laktat. Die Intensität der Laktatanreicherung in soliden Primärtumoren steht in engem Zusammenhang mit deren Strahlenresistenz, deren Metastasierungspotenzial und mit der Überlebensrate der Patienten. Die Wirksamkeit einer herkömmlichen Strahlentherapie beruht im Wesentlichen auf der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies, sog. ROS, die über die Erzeugung von irreparablen Schäden in der DNA zur Abtötung der Tumorzellen führen. Bestimmte Glykolyseprodukte, wie Pyruvat oder Laktat in hoher Konzentration, weisen antioxidative Eigenschaften auf und könnten somit die therapeutisch erwünschten ROS neutralisieren. Neben einem grundlegenden Erkenntnisgewinn sind von solchen Forschungsarbeiten neue therapeutische Ansätze durch eine Manipulation des Glukosestoffwechsels bösartiger Tumoren zu erwarten. . Ein solches "metabolisches Targeting" richtet sich nicht wie die meisten molekularen Strategien gegen bestimmte Rezeptor- oder Signalmoleküle, sondern gegen den besonderen metabolischen Gesamtzustand der Krebszelle. Weltweit werden derzeit solche Forschungskonzepte intensiv bearbeitet, und eine Reihe von vielversprechenden metabolischen Ansätzen befindet sich bereits in der klinischen Testung.

Abgeschlossene Projekte der letzten 5 Jahre:

1. "Bedeutung des Glukosestoffwechsels für die Strahlenempfindlichkeit solider Tumoren"

(gefördert durch die DFG: Mu 576/17-1; Teilvorhaben des DFG-Paketprojekts PAK 124: "Bedeutung der Hypoxie und des metabolischen Mikromilieus für die Strahlentherapie solider Tumoren).
Projektleitung: Prof. Dr. Wolfgang Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Dipl.-Biol. Sandra Meyer (promoviert zum Dr. rer. nat.); cand. med. Hannah Knörzer (promoviert zum Dr. med.); cand. med. Christian Hörner (promoviert zum Dr. med.); Georg Otto (TA)

In diesem Gesamtvorhaben in Zusammenarbeit mit den Universitäten Dresden, München und Würzburg konnte gezeigt werden, dass der Laktatgehalt in Experimentaltumoren verschiedener Plattenepithelkarzinom-Zelllinien einen prognostischen Marker hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber einer fraktionierten Strahlentherapie darstellt, dessen Signifikanz aber noch keine prädikative Aussage für einzelne Tumoren zulässt. Um diese Signifikanz möglicherweise zu erreichen, wurden Veränderungen des metabolischen Tumormilieus im Verlauf einer fraktionierten Röntgenbestrahlung erfasst. Dazu diente die bildgebende Biolumineszenzmethode ("induced metabolic Bioluminescence Imaging: imBI"), die in unserem Labor entwickelt wurde. Das Verfahren erlaubte die Messung des Gehalts an Laktat, Glukose, ATP und Pyruvat in unbehandelten und bestrahlten und humanen Tumorxenografts. Parallel dazu wurde der Expressionsstatus verschiedener glykolyserelevanter Gene auf mRNA- und Proteinebene analysiert. Die Arbeitshypothese, wonach die Berücksichtigung metabolischer Veränderungen während einer fraktionierten Strahlentherapie zu einer prädiktiven Signifikanz prätherapeutischer Stoffwechselparameter führen konnte, wurde widerlegt. Andererseits zeigte sich nach drei Bestrahlungsfraktionen auf transkriptioneller Ebene ein hochsignifikanter Unterschied in der Induktion glykolytischer Enzyme, wie der Hexokinase, zwischen strahlenempfindlichen und -resistenten Tumoren. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine PCR-basierte Messung des Induktionsverhaltens glykolytischer Enzyme zu Beginn einer klinischen Strahlentherapie eine Beurteilung des individuellen Ansprechens auf die Behandlung erlauben könnte. Dies würde einen wesentlichen Beitrag zur personalisierten Krebstherapie liefern.

2. "Untersuchungen zur Wechselbeziehung zwischen Proteom, Energiestoffwechsel, Redoxstatus und Radiosensibilität von Tumorzellen in vitro und in vivo

(gefördert durch die DFG: SA 1749/3-1)
Projektleitung: Dr. Ulrike Sattler
Projektbearbeitung: Dipl.-Biol. Christian Fabian (promoviert zum Dr. rer. nat), cand. med. Andrea Siebers (promoviert zum Dr. med.)

Sowohl auf Zell- als auch auf Tumorebene wurde die Hypothese überprüft, wonach eine hohe glykolytische Aktivität in Krebszellen zu einer Anreicherung von antioxidativen Metaboliten, dadurch zu einem geringeren Niveau an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und, damit verknüpft, zu einer Strahlenresistenz führt. Schwerpunkt des Projekts bildeten in Kooperation mit Dr. Stefano Indraccolo aus dem Krebsforschungsinstitut des Veneto in Padua Untersuchungen an humanen Ovarialkarzinom-Zelllinien, die intrinsische oder gentechnisch erzeugte Unterschiede in ihrer glykolytischen Aktivität aufwiesen, wohingegen sich die Proliferations- bzw. Wachstumsraten auf zellulärer Ebene und als xenotransplantierte Tumoren nicht voneinander unterschieden. Die molekularen Ursachen der metabolischen Unterschiede wurden auf transkriptioneller und proteomischer Ebene aufgeklärt. Auf beiden Ebenen zeigten die hochglykolytischen OC316-Zellen im Vergleich zu den niedrigglykolytischen IGROV1-Zellen eine statistisch signifikant höhere Expression mehrerer glykolyse-assoziierter Enzyme und Membrantransporter mit einem besonders drastischen Unterschied bei dem zellulären Laktat-Exporter Monocarboxylattransporter-4 (MCT4). Sowohl die funktionellen als auch die proteomischen Unterschiede zwischen beiden Zelllinien blieben bei xenotransplantierten Tumoren in der Nacktmaus erhalten: Implantation von OC316-Zellen erzeugte Hochlaktattumoren mit hoher MCT4-Expression, und bei IGROV1-Zellen verhielt es sich umgekehrt. Entgegen der Ausgangshypothese waren die zelluläre Strahlenempfindlichkeit und das ROS-Niveau höher in den hochglykolytischen OC316-Zellen als in den IGROV1-Zellen. Dieses zunächst unerwartete Verhalten konnte durch eine höhere Sauerstoffverbrauchsrate mit erhöhter ROS-Bildung in OC316-Zellen, sowie durch eine höhere DNA-Reparaturkapazität der IGROV1-Zellen (gemessen mit der gammaH2AX-Markierung) erklärt werden. Durch ausgedehnte Screening-Versuche konnte mittels eines DFG-finanzierten XF24 Seahorse Analysators eine Kombinationstherapie mit einem Glykolyse- und einem Atmungskettenhemmer entwickelt werden, die zu einer deutlichen Strahlensensibilisierung der Krebszellen führte. Dieses "metabolic targeting" muss nun in Xenografttumoren verifiziert werde.

3. "Gentechnische Erzeugung hoch- und niedrigglykolytischer Tumorzellen"

(gefördert durch die Stiftung Rheinland-Pfalz für Innovation: 961-38 62 61 / 822).
Projektleitung: Prof. Dr. W. Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Dr. Kristina Götze, cand. med. Jonas Harbath (promoviert zum Dr. med. ) 

Das Ziel des Projektes ist die Erzeugung von stabil transfizierten hoch- und niedrig-glykolytischen Tumorzelllinien. Es werden Zelllinien, die sich in der Produktionsrate von Pyruvat und Laktat unterscheiden, mit Hilfe gentechnischer Methoden hergestellt. Das T-REx™ System (Invitrogen) wurde für die Klonierung ausgesucht. Durch Einklonierung des Zielgens in natürlicher sense- und zum anderen in künstlicher antisense-Orientierung besteht die Möglichkeit, das Zielgen überzuexprimieren bzw. herunterzuregulieren. Nach der Klonierung werden die Zelllinien charakterisiert: Wachstumskurven, Laktatgehalt, LDH-Konzentration und -Aktivität. Im Anschluss wird die Strahlenwirkung von 1 bis 10 Gy mit Hilfe international standardisierter Tests quantifiziert; hierzu zählen der Koloniebildungstest mit Bestimmung der sog. Plating Efficiency (PE), die Erstellung von Überlebenskurven, die Erfassung des Anteils von Apoptosen an der Gesamtzahl bestrahlter Zellen und die Detektion von Einzel- und Doppelstrangbrüchen der DNA. Dadurch soll ein möglicher kausaler Zusammenhang zwischen dem Therapieverfahren und dem Glukosestoffwechsel bösartiger Tumoren untersucht werden.

4. "Etablierung organotypischer Co-Kulturen unter Beteiligung von humanen Abwehrzellen"

(gefördert durch die Programme der Universität Mainz MAIFOR/FORSCHUNGSFOND: 9728907).
Projektleitung: Dr. Ulrike Sattler
Projektbearbeitung: cand. med. Hannah Pfister, geb. Klein (promoviert zum Dr. med.), cand. biol. Henrike Schröer (jetzt Dipl.-Biol.)

Bei der Behandlung von Krebserkrankungen spielen aufgrund ihrer Wirksamkeit Chemo- und Strahlentherapien eine wichtige Rolle. Trotz intensiver Bemühungen können Therapien eine Reihe von Nebenwirkungen verursachen, zu denen auch entzündliche Veränderungen der Haut ("Strahlendermatitis") und der Schleimhäute (Mukositis) gehören. Durch die entzündlichen Veränderungen können Haut und Schleimhäute ihre Schutzfunktion nicht mehr aufrecht erhalten. Es besteht das Risiko, dass krankheitsverursachende Keime in den Körper eindringen und Infektionen auslösen, die die Krebstherapie erschweren. In diesem Projekt werden organtypische Co-Kultur-Modelle aus verschiedenen Zelltypen der (Mundschleim-)Haut und humanen Abwehrzellen (PBMC, Peripheral Mononuclear Blood Cells) zur Simulation immunregulatorischen Bedingungen etabliert. Mit diesen dreidimensionalen Modellen stehen im Vergleich zu Monolayer-Kulturen komplexere Versuchsmodelle zur Verfügung, welche eine Annäherung an die in vivo-Situation der (Mundschleim)Haut darstellen. Das entwickelte Modell könnte im Bereich der prä-klinischen Testung antioxidativer Substanzen eingesetzt werden, da reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zum einen eine wichtige Rolle in Entzündungsprozessen selbst spielen, zum anderen aber auch in der Tumortherapie die Wirkung vieler Chemotherapeutika und Behandlung mit ionisierender Strahlung vermitteln.

5. "Strahleninduzierte Mukositis als Risiko der Raumfahrt: Modelluntersuchungen an Schwerionen-bestrahlten organotypischen Zellkulturen"

(gefördert von der DLR/ESA mit Mitteln des BMWi, Förderkennzeichen 50WB0926; in Zusammenarbeit mit der ESA und GSI Darmstadt)
Projektleitung: Prof. Dr. Wolgang Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Dr. Ulrike Sattler; Dipl.-Chem. Viktoria Tschachojan (promoviert zum Dr. rer. nat.)

NASA und ESA planen derzeit bemannte Weltraummissionen zur Erkundung unseres Sonnensystems, insbesondere des Mondes und des Mars. Astronauten wären dabei über einen längeren Zeitraum hochenergetischer Weltraumstrahlung ausgesetzt, die (bisher) kaum abgeschirmt werden kann. In diesem Projekt wird analysiert, ob für Astronauten ein prinzipielles Risiko existiert, eine durch Weltraumstrahlung induzierte orale Mukositis zu entwickeln. Eine solche dicht ionisierende Strahlung erzeugt einen hohen Anteil komplexer DNA-Schäden, die vergleichsweise langsam und uneffizient repariert werden, und die eine hohe Gefahr für die Entwicklung systemischer Infektionen und ein Risiko der Carcinogenese per se darstellen. Im vorliegenden Projekt wurden anhand von organotypischen Kulturen unmittelbare und frühe Mechanismen der Induktion oraler Mukositis untersucht. Die Bestrahlungen wurden mit finanzieller Unterstützung durch die ESA an der GSI in Darmstadt durchgeführt, wo Weltallstrahlung wirklichkeitsnah simuliert werden kann. Analysen von strahleninduzierten Strukturveränderungen, DNA-Doppelstrangbrüchen, Apoptosen, Expression und Aktivierung spezifischer Transkriptionsfaktoren, pro-entzündlicher Interleukine und Cytokine belegen eindeutig die Existenz eines Risikos für die Entwicklung einer Mukositis. Die Befunde belegen den Bedarf weiterer Untersuchungen zu dieser Problematik im tierexperimentellen und translationalen Bereich.

6. "Entwicklung eines pharmakologischen Modells für Untersuchungen zur Wirkung von ertumaxomab (anti-Her2/neu + anti-CD3) in dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro"

(gefördert durch die Fa. Fresenius Biotech GmbH, München).
Projektleitung: Prof. Dr. Wolfgang Müller-Klieser und PD Dr. Stefan Walenta
Projektbearbeitung: Dr. Franziska Hirschhäuser

Der trifunktionale Antikörper ertumaxomab besitzt im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme. Einer davon ist gegen CD3 auf T Zellen, der zweite gegen Her2, einem weit verbreiteten Tumorantigen vorrangig von Mammakarzinomen, gerichtet. Neben dieser Bivalenz besitzt der Antikörper eine dritte Bindungsstelle für FcγRI/III positive, akzessorische Immunzellen. Diese einzigartige Kombination ermöglicht modellhaft die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T- Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Für mechanistische Untersuchungen verwenden wir ein 3D Tumormodell, das in unserem Labor sehr gut etabliert ist, multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS). Dabei stehen die Wechselwirkungen von Her2-positiven Tumorzellen mit Immunzellen im Vordergrund. Für die Analysen werden die Sphäroide mit peripheren mononukleären Zellen (PBMC) in miniaturisierten, rotierenden Spinnerflaschen mit variierenden Konzentrationen des Antikörpers ko-kultiviert. Der Effekt der Therapie wird anhand verschiedener Parameter, wie Sphäroidwachstum, Immunzellinfiltration, Vitalität, Klonogenität, Proliferation und Apoptosehäufigkeit, bewertet. Den Versuchen kommt eine große Bedeutung für die in vivo Untersuchungen zu, da MCTS die Strukturen avaskulärer Tumoren oder Mikroregionen solider Tumoren reflektieren.

2013 ausgelaufene Projekte:

7. "Wirkung von Schwerionen-Strahlung auf Migration und Invasivität von Tumorzellen"

(gefördert durch die DFG: MU 576/17-1;Gemeinschaftsprojekt mit Gisela Taucher-Scholz (TA 548/2-1), GSI Darmstadt und Nils Cordes (CO 6684-1), OncoRay, TU Dresden)
Projektleitung: Prof. Dr. W. Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Dipl. Biotechnol. Christina Stahler, geb. Faethe (promoviert zum Dr. rer. nat.)

Die Schwerionenbestrahlung sowie die konventionelle Strahlentherapie von Tumoren weisen beeindruckende klinische Erfolge auf. Gleichzeitig ergeben sich bei Tumorzellen in vitro jedoch Hinweise darauf, dass eine Röntgenbestrahlung Tumorzellwanderung fördert. Gerade bei der modernen Hochpräzissionstherapie könnte somit ein Auswandern von Tumorzellen in die Umgebung des Bestrahlungsvolumens zur lokalen Rezidivbildung beitragen. Zum Einfluss schwerer Ionen auf das Wanderungsverhalten von Tumorzellen gab es zu Projektbeginn keine ausreichenden Erkenntnisse. Im vorliegenden Forschungsprojekt konnte mit humanen Glioblastomzellen gezeigt werden, dass an der durch herkömmliche Strahlung induzierten Zellwanderung eine Aktivierung des EGF-Rezeptors (epidermal growth factor receptor) beteiligt ist. Tatsächlich ließ sich die migrationssteigernde Wirkung von Röntgenstrahlung durch EFG-R-Hemmstoffe unterdrücken. Umgekehrt trat nach einer Schwerionenbestrahlung durchweg eine Hemmung der Zellmigration bei fehlender EGF-R-Aktivierung auf. Somit ist bei dieser Strahlenart nicht mit einem migrationsbedingten Rezidiv zu rechnen. Zukünftige Untersuchungen müssen klären, inwiefern diese Befunde auf die in vivo-Situation übertragbar sind. Ein Verlängerungsantrag ist in Bearbeitung.

8. "Metabolische Marker der Strahlenresistenz und Bezug zu gentoxischen Endpunkten"

(gefördert durch das BMBF: 02NUK016A; Teilvorhaben des Kompetenzverbundes Strahlenforschung (KVSF) "Intrinsische Strahlenempfindlichkeit: Identifikation, Mechanismen und Epidemiologie(ISIMEP)")
Projektleitung: Prof. Dr. W. Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Dr. Nadine Völxen

Vorläuferprojekte haben gezeigt, dass eine starke Laktatakkumulation in Primärtumoren mit einer erhöhten Metastasierungsneigung, einer ausgeprägten Strahlenresistenz und einer verminderten Überlebensrate von Tumorpatienten einhergeht. Im vorliegenden Projekt konnten erstmals an prätherapeutischem Biopsiematerial von Glioblastompatienten metabolische Untersuchungen mit Hilfe des von uns entwickelten imBI- (induced metabolic Bioluminescence Imaging-) Verfahrens durchgeführt und mit klinischen Daten und metabolisch relevanten Proteinmarkern verglichen werden. Überraschenderweise deuten die bisher erhobenen Befunde an, dass - anders als bei allen anderen bisher untersuchten Tumorentitäten - eine hohe Laktatanreicherung im Tumorgewebe eher mit einer günstigeren Überlebensrate verknüpft ist. Dabei ist die Abhängigkeit der meisten klinischen Parameter vom Tumorlaktatgehalt generell relativ schwach ausgeprägt. Ebenso anders als in anderen Tumorarten zeigt sich in Glioblastomen eine hochsignifikante Korrelation zwischen dem Tumorlaktatgehalt und dem Expessionsniveau des Monocarboxylattransporters-1 (MCT1). Somit könnte dieser Membrantransporter als proteomischer Marker der Glykolyseaktivität von Glioblastomen dienen. Ein Verlängerungsantrag wurde gestellt.

9. "Induziertes metabolisches Biolumineszenz-Imaging (imBI) in Tumoren mit unterschiedlicher Stoffwechselaktivität"

(gefördert durch die DFG: DE 835/2-1; Teilvorhaben der Klinischen Forschergruppe 262 (KFO 262), Titel: "Der Tumormetabolismus als Modulator der Immunantwort und Tumorprogression", Klinikum der Universität Regensburg
Projektleitung: Prof. Dr. W. Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Anette Denner-Seckert (TA)

In Vorläuferuntersuchungen konnte die AG von Marina Kreutz (Koordinatiorin der KFO262) unter Beteiligung des Projektleiters zeigen, das in Tumoren angereichertes Laktat die effektorische Immunaktivität von dendritischen Zellen und zytotoxischen CD8-positiven T-Zellen herabsetzt. Damit trägt die glykolytische Aktivität in Tumoren zum Phänomen des "Immune Escape" bei. In enger Vernetzung mit den Teilprojekten der KFO sollte im vorliegenden Projekt untersucht werden, inwiefern durch eine pharmakologische oder gentechnische Manipulation des Tumorstoffwechsels das metabolische Escape-Phänomen unterdrückt oder vermindert werden kann. Auf der Basis der shRNA-Technologie gelang es, aus einer Mausmelanom-Zelllinie zwei stabile Sublinien mit hoher oder niedriger Laktatproduktion herzustellen. Mit Hilfe der imBI-Methode wurde nachgewiesen, dass von den beiden Sublinien im syngenen Mausmodell jeweils Hoch- bzw. Niederig-Laktattumoren erzeugt werden konnten. Erste Befunde deuten darauf hin, dass sich beide Tumortypen in ihrem Immunverhalten unterscheiden. Ein Verlängerungsantrag ist in Bearbeitung.

Für 2014 neu bewilligte Projekte:

10. "Ein neues Verfahren zur Funktionsbestimmung von Monocarboxylattransportern (MCTs) in Tumorzellen mit Hilfe der Positron-Emissions-Tomographie (PET)"

(gefördert durch die Stiftung Rheinland-Pfalz für Innovation: 961-38 62 61 / 1069)
Projektleitung: Prof. Dr. W. Müller-Klieser / PD Dr. Stefan Walenta
Projektbearbeitung: Dipl.-Biol. Gudrun Krumm /Nadine Dexheimer (TA)

Trotz der allgemeinen Anerkennung des Laktats als metabolische Schlüsselsubstanz in der Onkologie gibt es bis heute kein klinisch-relevantes, nicht-invasives Verfahren zur Messung des zellulären Exports oder Imports von Laktat über die zuständigen Transportproteine, den Monocarboxylattransportern (MCTs). Diese Lücke soll mit der angestrebten Entwicklung in Zusammenarbeit mit dem hiesigen Institut für Kernchemie geschlossen werden. Die Positron-Emissions-Tomographie (PET) hat sich in den vergangenen Jahren zunehmend als Methode für Stoffwechselmessungen am Menschen bewährt. Da Laktat jedoch nicht direkt als eine mit PET erfassbare Substanz, d. h. als PET-Tracer, geeignet ist, sollen metabolische Analoga mit Fluor-18 markiert und als PET-Laktatanaloga funktionell getestet werden. Hierzu sind Tracer- und PET-Versuche an vereinzelten Tumorzellen, 3D Zellmodellen und tumortragenden Labortieren vorgesehen. Sie dienen zur Quantifizierung der Funktion von MCTs und deren Beeinflussbarkeit durch pharmakologische Substanzen. Wichtig ist hier die parallele Validierung der gemessenen Größen mit in unserem Labor etablierten, standardisierten Methoden zur Charakterisierung der Laktatbiologie und der Strahlenempfindlichkeit der Krebszellen. Im Falle positiver Resultate wird die Translation der Ergebnisse in die Klinik angestrebt.

11. "Stoffwechselstatus der gesunden, metabolisch gestressten oder maligne entarteten Mundschleimhaut des Menschen"

(gefördert durch die DFG:)
Projektleitung: Dr. Dr. Dr. Thomas Ziebart; Prof. Dr. Wolfgang Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Dr.rer.nat. Nadine Völxen, cand. biol. Christina Appelhans

Das vorliegende Projekt basiert auf der Hypothese, wonach die Deregulierung des Glukosestoffwechsels eine frühe und möglicherweise kausale Veränderung während der Entstehung von Krebs darstellt. Daher soll die Charakterisierung des Stoffwechselstatus in der gesunden, der metabolisch gestressten und der maligne entarteten Mundschleimhaut im Zentrum des Vorhabens stehen. Als metabolische Stressparameter dienen Risikofaktoren und Komorbiditäten wie Adipositas, Alkohol- und Nikotinabusus bzw. Diabetes mellitus Typ II sowie lokale Traumata. Zielgrößen sind Glykolyse-assoziierte Metabolite und Proteine, insbesondere der Gehalt an ATP, Glukose, Pyruvat und Laktat, sowie das Expressionsniveau von Membrantransportern für den zellulären Glukoseimport (GLUT1/3) bzw. für den Laktatexport oder -import (MCT1/4). Diese Zielgrößen lassen sich mit klinischen Daten der Patienten korrelieren und damit auf ihre klinische Signifikanz hin überprüfen. Kernziel der Untersuchung ist die Erarbeitung eines Satzes metabolischer Parameter, der (i) die frühzeitige Krebsdiagnose verbessert, (ii) prädiktive Aussagen über den Malignitätsgrad der Tumorerkrankung erlaubt und (iii) so zu einer individualisierten Therapie beitragen kann.

12. "Induziertes metabolisches Biolumineszenz-Imaging (imBl) in Tumoren mit unterschiedlicher Stoffwechselaktivität

(gefördert durch die DFG: DE 835/2-2; Teilvorhaben der Klinischen Forschergruppe 262 (KFO 262), Titel: "Der Tumormetabolismus als Modulator der Immunantwort und Tumorprogression", Klinikum der Universität Regensburg
Projektleitung: Prof. Dr. W. Müller-Klieser
Projektbearbeitung: Anette Denner-Seckert (TA)

In Vorläuferuntersuchungen konnte die AG von Marina Kreutz (Koordinatiorin der KFO262) unter Beteiligung des Projektleiters zeigen, das in Tumoren angereichertes Laktat die effektorische Immunaktivität von dendritischen Zellen und zytotoxischen CD8-positiven T-Zellen herabsetzt. Damit trägt die glykolytische Aktivität in Tumoren zum Phänomen des "Immune Escape" bei. In enger Vernetzung mit den Teilprojekten der KFO sollte im vorliegenden Projekt untersucht werden, inwiefern durch eine pharmakologische oder gentechnische Manipulation des Tumorstoffwechsels das metabolische Escape-Phänomen unterdrückt oder vermindert werden kann. Auf der Basis der shRNA-Technologie gelang es, aus einer Mausmelanom-Zelllinie zwei stabile Sublinien mit hoher oder niedriger Laktatproduktion herzustellen. Mit Hilfe der imBI-Methode wurde nachgewiesen, dass von den beiden Sublinien im syngenen Mausmodell jeweils Hoch- bzw. Niederig-Laktattumoren erzeugt werden konnten und dass sich beide Tumortypen in ihrem Immunverhalten unterscheiden.

Methodenspektrum

induced metabolic Bioluminescence Imaging (imBI; Bildgebende Biolumineszenz):

Kartierung von Glukose, Laktat, Pyruvat und ATP

RT-PCR und quantitative PCR:

Enzyme und Transportproteine des Glukosestoffwechsels

Western Blotting:

Enzyme und Transportproteine des Glukosestoffwechsels

In Situ Hybridisierung:

Enzyme und Transportproteine des Glukosestoffwechsels

Northern und Southern Blotting:

Enzyme und Transportproteine des Glukosestoffwechsels

ELISA:

MTT/XTT-Test; Test für Caspasen

ELISA:

MTT/XTT-Test; Test für Caspasen; Interleukine, Cytokine

Histologie/Histochemie:

Kryo-Histologie, Paraffinhistologie

HPLC:

Energiereiche Phosphate, Glutathion, Glykolyseprodukte

Immunhistochemie:

BrdU, Ki67, TUNEL, FragEL, CD34, CD45 etc.; Enzyme und Transportproteine des Glukosestoffwechsels

Photometrie:

Enzymatische Standardtests;DNA- und RNA-Quantifizierung

Zellkultivierung:

Monolayer, dreidimensionale Kulturen (Späroide, Multilayer, organotypische Zellkulturen)

Vektortransfektion/Klonierung:

Manipulation der Glykolyse

Extrazelluläre Analysen in Echtzeit:(Seahorse Extracellular Flux Analyzer)

pH-Änderungen, O2-Verbrauch, CO2-Produktion