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Prof. Dr. Markus Christmann

Regulation der DNA-Reparatur nach genotoxischen Noxen

Zellen sind im Laufe ihres Lebens sowohl endogenen als auch exogenen Stressfaktoren ausgesetzt. Zu diesen Faktoren gehören DNA-schädigende Stimuli wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung, oxidativer Stress und chemische Mutagene. Um die DNA vor diesen Substanzen zu schützen, haben sich im Laufe der Evolution unterschiedliche DNA Reparatursysteme entwickelt, die sowohl der toxischen als auch der mutagenen Wirkung der DNA-Schädigung entgegen wirken.  Eine Übersicht über die unterschiedlichen Reparatursysteme der menschlichen Zelle finden Sie hier.

Christmann M., Tomicic M., Roos W., Kaina B. (2003) Mechanisms of human DNA repair: an update. Toxicology 193, 3-34

Im Zentrum unseres Interesses steht die Frage, wie Zellen auf die Behandlung mit unterschiedlichen mutagenen Agenzien reagieren und ob diese Behandlungen unterschiedliche Reparatursysteme aktivieren. Die Regulation der DNA-Reparatur kann über unterschiedliche molekulare Mechanismen erfolgen. Hierzu gehören die transkriptionelle Induktion von Genen, die Ab- und Anschaltung von Genen mittels Methylierung, die Translokation von Proteinen und die posttranslationale Modifizierung.

Im Laufe unserer Untersuchungen konnten wir zeigen, dass es nach Behandlung mit alkylierenden Agenzien zu einer Translokation der an der Fehlpaarungsreparatur beteiligten Gene MSH2 und MSH6 aus dem Zytoplasma in den Zellkern kommt. Zusätzlich konnte eine Phosphorylierung dieser Proteine nachgewiesen werden.

Christmann M., Tomicic M., Kaina B. (2002) Phosphorylation of mismatch repair proteins MSH2 and MSH6 affecting MutSalpha mismatch-binding activity. Nucleic Acids Research, 30, 1959-1966

Christmann M., Kaina B. (2000) Nuclear translocation of mismatch repair proteins MSH2 and MSH6 as a response of cells to alkylating agents. The journal of biological Chemistry. 275, 36256-36262

 

 

Durch genotoxischen Stress induzierte DNA-Reparaturgene

Transkriptionelle Regulation von DNA-Reparaturgenen nach gentoxischen Stress

Wie bereits erwähnt, reagieren Zellen auf gentoxischen Stress mit dem transkriptionellen An- und Abschalten bestimmter Gene. Zu den Transkriptionsfaktoren, welche direkt nach der DNA-Schädigung aktiviert werden, gehören das Tumorsuppressorprotein p53, sowie der dimere Transkriptionsfaktor AP-1, welcher aus Proteinen der fos/jun Familie gebildet wird. Diese Transkriptionfaktoren können die Induktion unterschiedlicher DNA-Reparaturgene induzieren.

Im Zentrum unserer Untersuchungen steht die Frage, wie die DNA-Reparatur durch genotoxischen Stress reguliert wird. In früheren Arbeiten haben wir uns hauptsächlich mit der transkriptionellen Regulation von DNA-Reparaturgenen nach Exposition von nicht-transformierten Zellen mit ultraviolettem (UVC) Licht beschäftigt. UVC-induzierte Läsionen werden durch die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) aus der DNA entfernt. Bei der transkriptionellen Regulation der NER-vermittelten Reparatur der UV-Schäden spielen die p53 und AP-1 die Hauptrolle. So ist p53 verantwortlich für die UVC-vermittelte Induktion der NER-Gene ddb2 und xpc. Ein weiteres Zielgen von p53, welches wir identifizieren konnten, ist die Flap Endonuklease (fen1). Die transkriptionelle Induktion von fen1 ist sowohl mit der Wiederaufhebung des UVC-induzierten DNA-Replikationsblocks als auch der Resistenz gegenüber UVC assoziiert. Neben p53-defizienten Zellen sind auch c-Fos-defiziente Zellen hypersensitiv gegenüber UVC. Die molekulare hierfür beruht darauf, dass c-Fos in murinen und humanen Fibroblasten die Expression der an der NER beteiligten Exonukleasen xpf und xpg vermittelt und darüber hinaus zu einer adaptiven Protektion der Zellen führt. Neben UVC vermittelten Regulation von xpf und xpg konnte auch eine c-Fos-vermittelte Induktion der „Three prime exonuklease I“ (TREX1) gezeigt werden. Diese Arbeiten zeigten, dass auch TREX1 bei der Resistenz gegenüber UVC beteiligt ist.

Tomicic, M. T., Reischmann, P., Rasenberger, B., Meise, R., Kaina, B. and Christmann, M. (2011) Delayed c-Fos activation in human cells triggers XPF induction and an adaptive response to UVC-induced DNA damage and cytotoxicity. Cell Mol Life Sci, 68, 1785-1798.

Christmann M., Tomicic M.T., Aasland D., Berdelle N. and Kaina B. (2010) Three prime exonuclease I (TREX1) is FOS/AP-1 regulated by genotoxic stress and protects against ultraviolet light and Benzo(a)pyrene-induced DNA damage. Nucleic Acids Research 38, 6418-6432.

Christmann M., Tomicic M., Aasland D., Kaina B. (2007) A role for UV-light-induced c-Fos: Stimulation of nucleotide excision repair and protection against sustained JNK activation and apoptosis. Carcinogenesis, 28, 183-190

Christmann M., Tomicic M., Origer J., Aasland D., Kaina B. (2006) c-Fos is required for excision repair of UV-light induced DNA lesions by triggering the re-synthesis of XPF. Nucleic Acids Research, 34, 6530-6539

Christmann M., Tomicic M., Origer J., Kaina B. (2005) Fen1 is induced p53 dependently and involved in the recovery from UV-light-induced replication inhibition. Oncogene, 24, 8304-8313

Neben Umweltkarzinogenen induzieren auch Zytostatika DNA-Schäden. Daher untersuchen wir auch die transkriptonelle Regulation von DNA-Reparaturfaktoren, sowie von apoptotischen Faktoren nach Behandlung mit Zytostatika wie dem methylierenden Zytostatikum Temozolomid (TMZ) und den chloroethylierenden Zytostatika Fotemustin und ACNU. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Resistenz von Melanomzellen gegenüber Fotemustin durch eine p53-abhängige Induktion der DNA-Reparaturgene TREX1 und POLH vermittelt wird. Weiterhin konnten wir zeigen, dass in Gliomzellen die mitochondriale Apoptose nach TMZ-Behandlung über c-JUN-abhängige Induktion des pro-apoptotischen Faktors BIM vermittelt wird:

Tomicic, M., Meise, R., Aasland, D., Berte, N., Kitzinger, R., Krämer, O.H., Kaina ,B. and Christmann, M. (2015) Apoptosis induced by temozolomide and nimustine in glioblastoma cells is supported by JNK/c-Jun mediated induction of the BH3-only protein BIM. Oncotarget. DOI: 10.18632/oncotarget.5274

Tomicic, M.T., Aasland, D., Naumann, S.C., Meise, R., Barckhausen, C., Kaina, B. and Christmann, M. (2014) Translesion Polymerase η Is Upregulated by Cancer Therapeutics and Confers Anticancer Drug Resistance. Cancer Res. 74, 5585-5596.

Tomicic, M.T., Aasland, D., Nikolova, T., Kaina, B. and Christmann, M. (2013) Human three prime exonuclease TREX1 is induced by genotoxic stress and involved in protection against UV light and anticancer drugs. BBA Molecular Cell Research 1833, 1832-1843.

 

 

Epigenetische Regulation von MGMT

Die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT), ist ein DNA-Reparaturprotein, welches Alkylierungen von der O6-Position des Guanins entfernt. Diese Schäden sind bei der Therapie mit dem methylierenden Zytostatikum Temozolomid und den chloroethylierenden Zytostatika ACNU, CCNU und Fotemustin für die Zytotoxitität verantwortlich, weshalb MGMT als Biomarker für Tumortherapie von Gliomen verwendet werden kann. In murinen Zellen konnte nach genotoxischem Stress eine transkriptionelle Induktion der MGMT Expression beobachtet werden. Daher stellte sich die Frage, ob es auch in menschlichen Zellen, insbesondere in Tumorzellen nach Behandlung mit Zytostatika zu einer transkriptionellen Aktivierung der MGMT kommt. In unseren Arbeiten, konnten wir zeigen, dass dies nicht der Fall ist. Weder kommt es nach Behandlung mit Temozolomid, CCNU oder ionisierender Strahlung zu einer Aktivierung des Promotors noch zu einer Änderung in der Expression der mRNA oder des Proteins (Aasland et al., in Vorbereitung).

In menschlichen Zellen scheint die Regulation von MGMT ausschließlich über Promotormethylierung zu erfolgen. So konnten wir zeigen, dass die Expression der MGMT in Melanomzellen durch Behandlung mit dem chloroethylierenden Zytostatikum Fotemustin erhöht wird, was auf einer verstärkten Methylierung im kodierenden Bereich des Genkörpers beruht (Christmann et al., 2001). In weiteren Arbeiten wurde in Hirntumoren die Aktivität der MGMT mit der Promotoraktivierung verglichen. Hierbei handelte es sich um ein Tumor-Kollektiv, welches Astrozytome WHO Grad III und Glioblastome WHO Grad IV umfasst. In diesem Kollektiv wurde die Expression von MGMT mittels Promotor-methylierungsspezifischer PCR (MSP)  sowie der direkten Bestimmung der MGMT-Aktivität in Glioblastomen und Astrozytomen untersucht. Es zeigte sich, dass beide Methoden in über 75% der Tumore ein übereinstimmendes Ergebnis liefern. In Weiterführung dieser Arbeiten konnten wir eine neue Technik (High Resolution Melting Point Analysis, HRM) zur Detektion der MGMT Promoter Methylierung etablieren, und zeigen, dass sie in Glioblastomen der klassischen HR überlegen ist.

Switzeny O., Christmann M., Renovanz M., Giese A., Sommer C., Kaina B. (2016) MGMT promoter methylation determined by HRM in comparison to MSP and pyrosequencing for predicting high-grade glioma response, Clinical Epigenetics, in press.

Christmann M., Nagel G., Horn S., Krahn U., Wiewrodt D., Sommer C., Kaina B. (2010) MGMT activity, promoter methylation and immunohistochemistry of pre-treatment and recurrent malignant gliomas: A comparative study on astrocytoma and glioblastoma. Int J Cancer, 127, 2106-2118

Christmann M, Pick M, Lage H, Schadendorf D, Kaina B. (2001) Acquired resistance of melanoma cells to the antineoplastic agent fotemustine is caused by reactivation of the DNA repair gene MGMT. Int J Cancer. 92, 123-129
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