• Erfassung der Zielantigene des antitumoralen T-Zellrepertoires
• Identifizierung von Zielantigenen autologer und allogener antitumoraler T-Zellen mittels cDNA-Expressionsklonierung
• Entwicklung aktiver und passiver antigenspezifischer Immuntherapieverfahren insbesondere gegen Antigene mit ausgewiesener Tumorspezifität und stabiler Expression
• Quantifizierung von antigenspezifischen T-Zellantworten mit Hilfe der ELISPOT-Technologie

Research Interests

• Analyses of target antigens of anti-tumor T cell repertoires
• Target antigen identification of tumor-reactive T cells via cDNA expression cloning techniques
• HLA-independent T cell recognition
• Development of active and passive antigen-specific immunotherapies, in particular against tumor-specific antigens with stable expression profiles
• Quantification of antigen-specific T cell responses using ELISPOT-technology

T-Zellen sind wesentliche Mediatoren effektiver Gewebeabstoßungsreaktionen und dauerhafter Immunprotektion. Während HLA-Klasse I-restringierte CD8+ T-Zellen in erster Linie Effektoren mit gewebedestruierendem Potential darstellen, unterstützen CD4+ T-Zellen ihre Expansion und die Ausbildung eines langfristigen immunologischen Gedächtnisses. Die Identifizierung T-zellerkannter Antigene ist eine der Voraussetzungen für die rationale Entwicklung spezifischer Tumorimmuntherapien. T-Zellen erkennen auf den Oberflächen ihrer Zielzellen nicht intakte Proteine, sondern kurzkettige Peptide, die im Zellinneren aus Proteinen jeglicher subzellulärer Lokalisation prozessiert werden und an HLA-Moleküle gebunden an die Zelloberfläche gelangen. T-Zellen können somit Veränderungen im Zellinneren von Tumorzellen gegenüber Normalzellen auf der Zelloberfläche erkennen. Sie sind dabei in zweifacher Hinsicht sehr sensitiv. Einerseits erkennen sie Veränderungen einer einzigen Aminosäureposition, und es genügt andererseits die Präsenz weniger Peptid-HLA-Komplexe für eine effektive T-Zellerkennung. Seit 1991 wurde eine Vielzahl von tumorassoziierten Antigenen veröffentlicht, die von T-Zellen erkennbar sind. Eine aktuelle Übersicht relevanter tumorassoziierter Peptidantigene, die von autologen T-Zellen auf menschlichen Tumoren erkannt werden, wird vom Cancer Research Institute geboten. Wir gehen davon aus, dass die Wege, die zur Tumorimmunität führen, nur dann wirklich therapeutisch genutzt werden können, wenn ein repräsentatives Spektrum relevanter Antigene bekannt ist, die in individuellen Patienten tatsächlich Ziel einer expansionsfähigen und potentiell gewebedestruierenden Immunantwort sind. Antigenen, die aufgrund ihrer Funktion stabil exprimiert werden, messen wir dabei besondere Bedeutung zu.

Background

T cells are crucial mediators of tissue rejection and long-lived immune protection. While HLA class I-restricted CD8-positive T cells are the primary effectors of tissue destruction, CD4-positive T cells support their expansion and memory formation. The identification of T cell target antigens is a prerequisite for the rational development of specific tumor immunotherapies. T cells recognize peptides bound to and presented by HLA molecules on the surfaces of target cells. The peptides are processed from proteins derived from any subcellular compartment. In this way, T cells sense differences between tumor and normal cells. Their sensitivity is exceptional in several aspects: On the one hand, even changes at single amino acid positions can be detected by T cells; on the other hand, the presence of very few peptide-HLA-complexes on target cell surfaces is sufficient for effective T cell recognition. Since 1991 a variety of T cell-recognized tumor-associated antigens has been published. A current list of relevant tumor-associated peptide antigens recognized by autologous T cells on human tumors is provided by the Cancer Research Institute. We hypothesize that ways leading to tumor immunity can only be addressed therapeutically when we know a representative spectrum of relevant tumor antigens, i.e. antigens targeted by immune responses with high proliferative and tissue destructive potential in any individual patient. In this context we consider functional antigens with stable expression profiles particularly important.

Wir verwenden ein von uns modifiziertes Verfahren des T-zellbasierten cDNA-Expressions-screenings, um die Zielantigene autologer und allogener antitumoraler T-Zellantworten (vorwiegend bei Melanomen und bei akuten myeloischen Leukämien) zu identifizieren. 
 
Tumor/Leukämie-reaktive T-Zellen werden in sog. autologen gemischten Lymphozyten/Tumorzell-Kulturen (MLTC) oder in allogenen gemischten Lymphozyten/Leukämiezell-Kulturen (allo-MLLC) stimuliert und dadurch expandiert und angereichert. Die MLTC/MLLC-Responderlymphozyten werden auf die Erkennung autologer Tumorzellen überprüft und schließlich in Aliquots kryokonserviert. Gelingt die Expansion Tumor/Leukämie-reaktiver CD8⁺ T-Zellen, werden die HLA-Klasse I-Allele des betreffenden Patienten kloniert. Unabhängig generierte CD8⁺ Responder-Lymphozyten-populationen werden in einem Paneltest auf Reaktivität gegen bereits bekannte Tumor/Leukämie-assoziierte Antigene überprüft. Dabei erwies sich der ELISPOT-Assay als essentiell für das Screening mit nicht-klonalen kryokonservierten T-Zellpopulationen. 
 
Aus eigenen Vorarbeiten und in einem Kooperationsprojekt mit dem Ludwig Institut für Krebsforschung in Brüssel (Prof. Pierre van der Bruggen) steht uns ein Panel von derzeit 31 cDNA-Klonen in Expressionsplasmiden zur Verfügung, die für bekannte, strukturell normale Antigene kodieren. Diese Panelantigene werden mit jedem der HLA I-Allele des jeweiligen Patienten in COS-7- oder 293T-Zellen transfiziert. Die Transfektanten werden dann im IFN-g-ELISPOT-Assay auf Erkennung durch MLTC/MLLC-Responder getestet. Dabei wird herausgefunden, ob in den MLTCs/MLLCs T-Zellen mit Reaktivität gegen eines oder mehrere der Panel-Antigene enthalten sind. Zum Teil werden dabei neue Peptide entdeckt, die aus den bekannten Proteinantigenen prozessiert und an der Zelloberfläche präsentiert werden. 
 
Mit MLTC/MLLC-Respondern oder aus ihnen abgeleiteten CTL-Klonen, die nicht bekannte Antigene erkennen, wird ein cDNA-Bank-Screening durchgeführt. Hierfür werden aus den Tumorzelllinien bzw. Leukämiezellen der untersuchten Patienten cDNA-Banken in geeigneten Expressions-plasmiden hergestellt. Jede Bank wird zunächst in Pools von je 100 cDNA-Klonen unterteilt (100xPools). Plasmide dieser Pools werden mit Plasmiden, die für restringierende HLA-Allele kodieren, bspw. in COS-7-Zellen transfiziert und die Transfektanten werden mit dem IFN-g-ELISPOT-Assay auf Erkennung durch T-Zellen getestet (CD8⁺ MLTC-Responder bzw. CTL-Klone). 100xPools, die INF-g-Spots induzieren, werden schrittweise kloniert. Antigenexprimierende cDNA-Klone werden sequenziert. Zum Vergleich werden homologe Sequenzen aus Datenbanken herangezogen sowie Sequenzen homologer cDNA aus nicht-malignen Zellen des jeweiligen Patienten. Weitere Schritte beinhalten die Eingrenzung der peptid-kodierenden Region bis hin zur Identifizierung des jeweiligen T-Zell-erkannten Peptids. 
 
Dieses Verfahren ermöglichte uns Analysen des antitumoralen T-Zell-repertoires in einer bislang nicht erreichten Komplexität und führte zu einer Beschleunigung und höheren Erfolgsquote. Es wird von uns für detaillierte Analysen des antitumoralen T-Zellrepertoires bei Melanompatienten (V. Lennerz et al., PNAS 102:16013, 2005) und für die Identifizierung von Kandidaten-Zielantigenen der Graft-versus-Host-Erkrankung und des Graft-versus-Leukämie-Effekts bei der allogenen Blutstammzelltransplantation (C. Wölfel et al., Cancer Immunol Immunother 57(6):849-57, 2008) eingesetzt. Dabei führt die T-Zell-basierte Expressionsklonierung zu eigenständigen Informationen, die von "T-Zell-freien" Antigenidentifizierungsverfahren bislang nicht abgedeckt sind. 
 
Gründe hierfür sind v. a.:

• die Sensitivität der T-Zellerkennung, die von effektorunabhängigen biochemischen Verfahren nicht erreicht wird, und
• die Fähigkeit zur Entdeckung genetisch alterierter Antigene, die effektorunabhängige Genom-, Transkriptom- bzw. Proteom-weite Screeningverfahren in ihrer derzeitigen Abhängigkeit von relativer Überexpression nicht erfassen.

Initiativbewerbungen für Masterarbeiten oder Doktorandinnen und Doktoranden sind immer herzlich willkommen. 
Bei Interesse melden Sie sich gerne bei:  

Prof. Dr. med. Thomas Wölfel
thomas.woelfel@unimedizin-mainz.de