Was ist Durchflusszytometrie?

Einleitung

Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Untersuchung physikalischer Eigenschaften von einzelnen Partikeln (z.B. Zellen, Kunststoffkügelchen usw.) in einem Flüssigkeitsstrom. Unter den physikalischen Eigenschaften, welche analysiert werden können, sind die Partikelgröße sowie die Granularität der Partikel. Außerdem kann das Fluoreszieren der Partikel in verschiedenen Wellenlängen untersucht werden. Häufig wird für Durchflusszytometrie der Begriff „FACS“ verwendet. „FACS“ steht für Fluorescence Activated Cell Sorting und beschreibt das Trennen einzelner Zellen anhand der analysierten Parameter von der restlichen Zellsuspension. Dies ist neben der reinen Zellanalyse eine weitere Anwendung im Bereich der Durchflusszytometrie.

 

Das Prinzip

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können Moleküle an der Zelloberfläche oder intrazellulär sowie Proteine quantitativ bestimmt werden. Hierfür werden in der Regel die zu untersuchenden Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Molekülen (Antikörper, Rezeptoren, Streptavidin, usw.) markiert. Zur Analyse werden die markierten Zellen als Einzelzellsuspension durch die Technik der hydrodynamischen Fokussierung wie auf einer Perlenkette aufgefädelt an einem gebündelten Laserstrahl mit geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet. Bei Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch das monochromatische Licht des Laserstrahls werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben. Nach dem Laserpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen) auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die Menge der emittierten Photonen, die ein spezifisches Emissionsspektrum aufweisen und durch einen Photodetektor detektiert werden, verhält sich proportional zur Menge an markierten Molekülen oder Antikörpern pro Zelle. Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und Streuung Informationen über die Zellgröße und die Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas, Größe des Zellkerns usw.) der Zellen gewonnen. Eine gleichzeitige Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen Wellenlänge anregen lassen aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff charakteristische Emissionsspektren verfügen.

Häufige Anwendungen

• Bestimmung des DNA-Gehalts mit einem DNA-Interkalator (z.B. Propidiumiodid) zur Analyse der Zellzyklusphasen oder der subG1-Fraktion (Marker für Apoptose).
• AnnexinV/PI-Doppelfärbung zur Diskriminierung apoptotischer und nekrotischer Zellen.
• Quantifizierung von Oberflächenproteinen auf Zellen des Blutsystems mit Hilfe von Fluorochrom-markierten Antikörpern.
• Analyse der GFP-Expression (z.B. zur Ermittlung der Transfektionseffizienz oder des Transkriptionslevels einzelner Gene).
• Sortieren einzelner Zellpopulationen aus komplexen Zellsuspensionen (z.B. Blut) anhand der analysierten Parameter.
• Zahlreiche weitere…