Visual Universitätsmedizin Mainz

Arbeitsgruppe Angewandte Molekularbiologie

Die Schwerpunkte der Forschungsarbeiten der ERC Advanced Investigator Grant Gruppe von Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. Werner E.G. Müller, die auch die Gruppen von Frau Prof. Dr. Xiaohong Wang, Prof. Dr. Dr. Heinz C. Schröder und Dr. Matthias Wiens umfasst, liegen in den Bereichen:

Molekulare Biomineralisation

Von den evolutionär ältesten Tieren bis zum Menschen werden die molekularen Mechanismen, die der Biomineralisation zugrunde liegen, untersucht. Es gelang uns zu zeigen, dass die Bildung der Hauptgruppen an Biomineralen (Silica, Calciumcarbonat und Calciumphosphat), einschließlich des Hydroxylapatits (HA) des Knochens, über enzymatische Prozesse erfolgt.

Abbildung 1
Morphogenetisch aktive anorganische Biomaterialien bei der menschlichen Knochenbildung.

Unsere Entdeckungen ermöglichten die Entwicklung neuer Strategien für das Tissue Engineering und die Reparatur von Knochen und Knorpel. Wir konnten zeigen, dass die Mineralisierung des menschlichen Knochens durch eine Carboanhydrase (CA IX)-vermittelte Bildung Calciumcarbonat-"Bioseeds" ausgelöst wird. Die anfänglich gebildeten amorphen Calciumcarbonat (ACC)-Ablagerungen werden dann durch Carbonat-Phosphat-Austausch in amorphes Calciumphosphat (ACP, HA-Vorläufer) umgewandelt. Dabei wird das Phosphat wiederum enzymatisch durch Hydrolyse von anorganischem Polyphosphat (PolyP) über die alkalische Phosphatase (ALP) bereitgestellt, ein Schlüsselenzym der Osteoblasten. ACC stimuliert auch die Knochenbildung, aber nur so lange es in amorpher Form vorliegt. Das amorphe ACC wandelt sich rasch in die stabileren kristallinen Polymorphen Vaterit, Aragonit und Calcit um. Wir konnten zeigen, dass ACC durch PolyP stabilisiert werden kann. Das resultierende Material stimuliert die Knochenbildung sowohl in vitro als auch in vivo.

Anorganisches Polyphosphat, ein energiereiches Biopolymer

Abbildung 2
Grundlegende Entdeckungen und Anwendungen von PolyP, insbesondere in der Humantherapie. Die Entwicklung von morphogenetisch aktiven, amorphen PolyP-Nano/Mikropartikeln und die Einführung von 3D-Drucktechnologien führten zu einer Reihe innovativer Anwendungen, die von der Zahnversiegelung bis zu Wundheilungsmaterialien, der Stimulierung der Angiogenese und einer neuen Generation von Knochen- und Knorpel-Implantatmaterialien reichen.

Polyphosphate (PolyP) bestehen aus zahlreichen, bis zu 100 oder mehr Phosphatresten, die durch energiereiche Phosphoanhydrid-Bindungen miteinander verknüpft sind. Ursprünglich nur in Bakterien und Hefen gefunden, identifizierten wir später PolyP auch bei Tieren einschließlich dem Menschen. Wir fanden heraus, dass vergleichsweise hohe Mengen an PolyP in menschlichen Osteoblasten und Thrombozyten vorhanden sind, aber auch extrazellulär im Blutplasma. Insbesondere entdeckten wir, dass PolyP als extrazellulärer Energiespeicher und Signalmolekül dient. Wir konnten zeigen, dass extrazelluläres ATP aus PolyP über die kombinierte Wirkung der zellmembranständigen ALP und der Adenylatkinase (AK) gebildet werden kann, die die Reaktion 2 ADP ↔ AMP + ATP katalysiert. Dies macht PolyP besonders interessant, wenn es zur energieabhängigen Regeneration von bradytrophen Geweben wie Knorpel verwendet wird.

Abbildung 3
Das anorganische Biopolymer PolyP als energielieferndes Molekül im extrazellulären Raum. Gezeigt ist die PolyP-gesteuerte Phosphorylierung von AMP zu ATP über ADP. (A) In Gegenwart des AK-Inhibitors A(5')P5(5')A wird PolyP extrazellulär über die ALP unter gleichzeitiger Erhöhung des ADP-Pools hydrolysiert. (B) In Abwesenheit von A(5')P5(5')A wird die während des Abbaus von PolyP durch die ALP freigesetzte metabolische Energie in ADP gespeichert, das dann in ATP und AMP umgewandelt wird.

Mit einem neu entwickelten Verfahren konnten wir amorphe Nano- und Mikropartikel aus dem Calciumsalz von PolyP herstellen. Diese amorphen Ca-PolyP-Nano/Mikropartikel sind stabil und werden nach Umwandlung in ein Coacervat in Gegenwart von Protein morphogenetisch aktiv und biologisch abbaubar. Sie zeigen eine starke stimulierende Wirkung auf die HA-Synthese von Knochen. Durch die Kombination von PolyP mit anderen, hydrogelbildenden Polymeren konnten 3D-druckbare Hybridmaterialien entwickelt werden, die durch Bildung von Ca2+-Brücken härtbar sind. Diese Gerüste sind sowohl in vitro als auch in vivo morphogenetisch aktiv.

Abbildung 4
Amorphe Ca-PolyP-Nanopartikel. Links: Morphologie und elektrisches Potential der Nanopartikel. Rechts: Umwandlung der PolyP-Nano/Mikropartikel in ein Coacervat in Gegenwart von Protein. Während dieses Prozesses nimmt das Zeta-Potential ab, wodurch die Bildung von Coacervataggregaten ermöglicht wird, die die Wachstums/Differenzierungs- und Mineralisierungsfähigkeit von mesenchymalen Stammzellen und knochenbildenden SaOS-2-Zellen erhöhen.

Bioinspirierte Materialien für die Regenerative Medizin

Aufbauend auf unseren Ergebnissen in der Grundlagenforschung entwickeln wir neuartige Materialien für medizinische Anwendungen (Knochen- und Knorpelimplantate, künstliche Blutgefäße und Hornhäute), insbesondere für den 3D-Druck und das 3D-Bioplotting. Der Schwerpunkt liegt auf morphogenetisch aktiven anorganischen Polymeren, insbesondere energiereichen und „smarten“ amorphen PolyP-Nano/Mikropartikeln mit verschiedenen Metallionen sowie deren Kombination mit bioinerten Materialien. Diese Forschungsarbeiten werden unter anderem durch drei ERC-Proof-of-Concept-Grants ("Si-Bone-PoC", "MorphoVES-PoC" und "ArthroDUR"; Koordinator: W.E.G. Müller) finanziert. Erste regenerativ aktive Implantatmaterialien wurden bereits im Tierversuch getestet und sollen in die klinische Anwendung gebracht werden. Diese biokompatiblen und biologisch abbaubaren Materialien ermöglichen einen schnellen und vollständigen Ersatz durch körpereigenes Gewebe, ohne dass eine Supplementierung mit (Stamm-)Zellen oder Zytokinen/Wachstumsfaktoren erforderlich ist.

Abbildung 5
PolyP als „smartes“ Nano/Mikro-Biomaterial.
Links: Unsere Technologie ermöglicht die Herstellung von amorphen Nano/Mikropartikeln aus PolyP mit verschiedenen Kationen, die die Wundheilung und Knorpelbildung (Mg-PolyP) beschleunigen, die Knochenbildung induzieren (Ca-PolyP) oder die Mineralisierung stimulieren (Sr-PolyP).
Darüber hinaus kann PolyP als "Käfig" zur Einkapselung von Arzneimitteln dienen, z.B. zur Behandlung von Knochentumoren und Metastasen.
Rechts: Anwendung verschiedener Materialien auf PolyP-Basis im Tissue Engineering.

Beispielsweise wurde eine morphogenetisch aktive Biotinte mit amorphen Ca-PolyP-Mikropartikeln und Poly-ε-Caprolacton (PCL) für die potenzielle Reparatur von größeren Knochendefekten sowie Mg-PolyP-Mikropartikel mit viskoelastischen Eigenschaften entwickelt, die denjenigen von Knorpel ähnlich sind, für eine mögliche Behandlung von Arthrose. Noch wirksamer als Ca-PolyP bei der Knochenheilung sind die mit dem Strontiumsalz von PolyP erhaltenen Mikropartikel, die nicht nur die Expression von ALP und BMP-2 in Osteoblasten und MSC erhöhen, sondern auch die Expression von Sclerostin, einem negativen Regulator des Wnt-Signalwegs und Inhibitor der Differenzierung und Mineralisation von Knochenzellen.

Abbildung 6
3D-gedrucktes PCL-Scaffold (A und B) und Scaffold, das mit PCL/Ca-PolyP-Mikropartikeln hergestellt wurde (B und D). Die Adhäsion und das Wachstum von SaOS-2-Zellen an dem PCL-Scaffold (E und F) und dem PCL/Ca-PolyP-MP-Scaffold sind gezeigt (G und H). Färbung mit Calcein für lebende Zellen (E und G) und mit DRAQ5 für die Gesamtzellzahl (F und H).

Polyphosphate zur Wundheilung und für die Mikrovaskularisation

Darüber hinaus entwickeln wir mit Ca-PolyP neue Strategien zur Stimulierung der Mikrovaskularisation/Angiogenese und zur Wundbehandlung. Beispielsweise wurde gefunden, dass die topische Anwendung von morphogenetisch aktiven PolyP-Mikropartikeln im Tierversuch eine deutliche Beschleunigung der Wundheilung bei normalen und diabetischen Mäusen, die eine verzögerte Wundheilung zeigen, bewirkt.

Abbildung 7
Einfluss von PolyP auf die Zellmigration während der Anfangsphase der Mikrovaskularisation.
(A) Schema: Im extrazellulären Raum werden die PolyP-Nanopartikel über die ALP und die AK zur Synthese von ADP/ATP verwendet, die als metabolischer Brennstoff dienen und den P2Y13- oder P2Y1-Rezeptorsignalweg modulieren. Zusammen mit VEGF regulieren die Zellen über GLUT1 den Glukoseimport in die Zellen. Das durch Glykolyse erzeugte ATP baut einen intrazellulären ATP-Gradienten auf. Die Zellmigration erfolgt entlang der Richtung des intra/extrazellulären ATP-Gradienten.
(B-D) Stimulation der Anfangsphase der Mikrovaskularisation durch Ca-PolyP-Mikropartikel im "tube formation assay". Die Zellen (HUVEC) wurden mit Calcein angefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. (B und C) Kontrollen ohne Ca-PolyP-Mikropartikel und (D und E) Assays mit Ca-PolyP-Mikropartikeln nach einer Inkubationszeit von 4 (B, D) bzw. 8 Stunden (F, E).